張校通*， 趙令卉，王小燕，王翔，申重陽，鄭榆坤

（成都清科生物科技有限公司，成都，610000）

臍帶血單核細(xì)胞是較為常見的一類細(xì)胞，用途較為廣泛，內(nèi)含豐富的造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等，且分離的臍帶血單核細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)成為在腫瘤的防治中具有重要作用的CIK（Cytokine-Induced Killer, CIK）細(xì)胞。如何保證提取臍血單核細(xì)胞的質(zhì)量，減少對(duì)后期細(xì)胞培養(yǎng)的影響，成為單核細(xì)胞提取過程中共同關(guān)注的話題。淋巴細(xì)胞分離液的選擇不僅決定著單核細(xì)胞分離的效果，而且對(duì)后期CIK誘導(dǎo)培養(yǎng)也有著重要的影響。為了在達(dá)到理想的分離提取效果以及盡可能節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，我們通過使用兩種不同品牌的淋巴細(xì)胞分離液，觀察使用兩種不同分離液對(duì)臍帶血單核細(xì)胞分離效果及對(duì)后期培養(yǎng)的影響，為進(jìn)一步研究臍血來源CIK的生物學(xué)特性奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

主要儀器及耗材：離心機(jī)（湖南湘麓公司）；生物安全柜（珠海市再鑫儀器有限)；細(xì)胞培養(yǎng)箱（三洋公司）；離心管（CORNING）；移液槍（fastpette）；注射器(新葉牌）；移液管（CORNING）；T175培養(yǎng)瓶（CORNING）；普通顯微鏡（奧林巴斯公司）；血球計(jì)數(shù)板（求精公司）。

主要實(shí)驗(yàn)試劑：PBS（Hyclone）；ficoll淋巴細(xì)胞分離液（GE healthcare）；TBD淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝洋生物科技有限公司）；細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone）。

1.2 方法

1.2.1 臍帶血單核細(xì)胞的提取

接收到經(jīng)產(chǎn)婦同意采集的四份臍帶血后，將其編為1、2、3、4號(hào)，各份血樣平均分成兩份放入離心管內(nèi)離心，根據(jù)液體的量加入兩倍體積生理鹽水混勻。然后分別以1.5∶1的比例緩慢等量加入兩種淋巴細(xì)胞分離液然后離心，吸取中間的白細(xì)胞層進(jìn)入離心管，根據(jù)吸入液體的量加入PBS，將細(xì)胞和PBS混勻、離心。進(jìn)過兩次PBS洗滌后用移液管吸取棄掉離心管上面的PBS，保留離心管底部的細(xì)胞。記錄細(xì)胞的密度及活率。

1.2.2 臍帶血單核細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)

把用兩種不同淋巴細(xì)胞分離液提取的臍帶血單核細(xì)胞分別裝入T175的培養(yǎng)瓶里，然后加入25mL的誘導(dǎo)液，把細(xì)胞搖勻后放入37℃二氧化碳濃度5%的培養(yǎng)箱進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)期間，根據(jù)細(xì)胞的生長密度經(jīng)兩種分離液提取的細(xì)胞定期加入或棄掉相同的培養(yǎng)液。在細(xì)胞培養(yǎng)的第0、4、8、12、16、20天取樣進(jìn)行細(xì)胞活率及密度的測(cè)定。觀察兩種不同培養(yǎng)液提取細(xì)胞對(duì)后期培養(yǎng)的影響。

1.2.3 細(xì)胞密度及活率的測(cè)定

（1）密度測(cè)定：將血球計(jì)數(shù)板及蓋片用綢緞布擦拭干凈，并將蓋片蓋在計(jì)數(shù)板上。將7～10μL細(xì)胞懸液滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片及計(jì)數(shù)板間。靜置1min后鏡下觀察，計(jì)算計(jì)數(shù)板四大格細(xì)胞總數(shù)。

細(xì)胞數(shù)/mL = 4大格細(xì)胞總數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×10000

（2）活率測(cè)定：將細(xì)胞懸液0.5 mL加人Ep管中，加入等量的0.4%臺(tái)盼蘭染液，染色2～3min。取7～10μL懸液涂于載破片上并加上蓋片，鏡下取任意視野分別計(jì)死細(xì)胞及活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活率。

細(xì)胞活率=活細(xì)胞數(shù)/ (死細(xì)胞數(shù)+活細(xì)胞數(shù))

2 結(jié)果

2.1 兩種分離液的提取效果及比較

臍帶血分別加入兩種不同分離液離心后，管中內(nèi)容物分為3個(gè)清晰的層面：上層為血漿(內(nèi)含血小板)，中間層為分層液，底層為紅細(xì)胞和多形核白細(xì)胞[1]。在上層清晰的橙紅色液體與中層清亮透明液體交界處可清楚地見到環(huán)狀乳白色的層面，即為臍帶血單核細(xì)胞層（如圖1）。GE淋巴細(xì)胞分離液分離的細(xì)胞數(shù)量較多但明顯含有較多紅細(xì)胞，而國產(chǎn)TBD淋巴細(xì)胞分離液中紅細(xì)胞較少。離心洗滌后，可以看到A管中沉淀到底層的紅細(xì)胞比B管中紅細(xì)胞少很多（如圖2）。顯微鏡觀察結(jié)果也表明GE淋巴細(xì)胞分離液提取出的臍帶血單核細(xì)胞比TBD淋巴細(xì)胞分離液提取出的數(shù)量較多，但其中含有大量的紅細(xì)胞（如圖3）。

圖1 兩種分離液的提取效果

A管為國產(chǎn)TBD牌淋巴細(xì)胞分離液分離后的效果；B管為用進(jìn)口GE healthcare淋巴細(xì)胞分離液分離后的效果。

圖2 PBS清洗離心后效果

A管為國產(chǎn)TBD牌淋巴細(xì)胞分離液分離提取后經(jīng)PBS清洗離心得到的效果；B管為用進(jìn)口GE healthcare淋巴細(xì)胞分離液分離提取后經(jīng)PBS清洗離A是用國產(chǎn)的TBD淋巴細(xì)胞分離液提取的結(jié)果；B是用進(jìn)口的GE healthcare淋巴細(xì)胞分離液提取的結(jié)果。

2.2 單核細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)后CIK細(xì)胞的密度及活率

2.2.1 CIK細(xì)胞的密度

表1 兩種分離液提取單核細(xì)胞的密度

由表1可以看出，用GE淋巴細(xì)胞分離液提取的單核細(xì)胞數(shù)量比用TBD淋巴細(xì)胞分離液提取的多。但實(shí)驗(yàn)也表明用GE淋巴細(xì)胞分離液提取的單核細(xì)胞中紅細(xì)胞比較多。在后期的誘導(dǎo)培養(yǎng)中，可以看到兩種方法離細(xì)胞的密度逐漸的接近。

2.2.2 CIK細(xì)胞的活率

由表2可以看出，用TBD淋巴細(xì)胞分離液提取的單核細(xì)胞與用GE淋巴細(xì)胞分離液提取的單核細(xì)胞活率接近，都可以達(dá)到90%以上，兩種分離液分離細(xì)胞在后期培養(yǎng)中無明顯差別。

?

3 討論

臍帶血單核細(xì)胞是一種用途非常廣泛的細(xì)胞，可以分化為多種細(xì)胞，經(jīng)過誘導(dǎo)成為CIK細(xì)胞是一種新型的免疫細(xì)胞。與傳統(tǒng)免疫細(xì)胞相比，CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤具有更強(qiáng)大的體內(nèi)外殺傷活性[2]。它主要由CD3+CD56+和CD3+CD8+組成，其兼具T細(xì)胞的抗瘤活性和自然殺傷細(xì)胞非MHC限制性殺瘤作用。抗瘤性高于淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞[3]。臨床應(yīng)用表明CIK細(xì)胞對(duì)腫瘤患者微小殘留灶有較好療效[4]，在結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞進(jìn)行腫瘤特異性治療[5]、基因治療[6]等方面有更深入的臨床研究價(jià)值。所以，對(duì)臍血單核細(xì)胞提取的質(zhì)量要求極為嚴(yán)格，本試驗(yàn)通過比較驗(yàn)證了不同淋巴細(xì)胞分離液對(duì)細(xì)胞分離效果及對(duì)后期培養(yǎng)的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，兩種淋巴細(xì)胞分離液的分離效果及后期誘導(dǎo)培養(yǎng)CIK細(xì)胞的影響，我們發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)的TBD淋巴細(xì)胞分離液和進(jìn)口的GE淋巴細(xì)胞分離液相比，前者離心后分層更清楚，提取更方便。雖然提出的單核細(xì)胞的量要比進(jìn)口的GE淋巴細(xì)胞分離液提出的少一些，但后者里面所摻雜的紅細(xì)胞較多，且隨著后期培養(yǎng)二者無論在細(xì)胞密度還是活率上都已十分接近，無疑在此實(shí)驗(yàn)中使用TBD分離液比較經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。

通過實(shí)驗(yàn)，為臍血單核細(xì)胞提取實(shí)驗(yàn)中淋巴細(xì)胞分離液的選擇提供了參考，并且通過對(duì)腫瘤有殺傷作用的CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)驗(yàn)證了對(duì)后期培養(yǎng)的影響，也為腫瘤疾病的預(yù)防和治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1]吳鵬，劉映峰，梁東輝，陳允欽.提高人外周血單核細(xì)胞分離率的方法探討[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24(5)：707-708.

[2]Nagaraj S, Iske ZC, Schmidt-wolf Ki. Human cytokine-induced killers have enhanced in vitro cytolytic activity vianon-viral IL-2 gene transfer [J]. Genet Vaccine Ther, 2004, 2(1):12.

[3]Matsuda K, Tsunoda T, Tanaka H, et al. Enhancement of cytotoxic tlymphocyte responses in patients with gastrointestinal malignancies following vaccination with CEA peptide-pulsed dendritic cells[J]. Cancer Immunology Immunotherapy, 2004,53(7): 609-616.

[4]匡志鵬，梁安民.CIK細(xì)胞聯(lián)合樹突狀細(xì)胞治療惡性腫瘤的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2006，14(2)：240-242.

[5]SCHMIDT-WOLF IG, FINKE S, TROJANECK B, et al. Phase I clinical study applying autologous immunological effector cells transfected with the interleukin-2 gene in patients with metastatic renal cancer, colorectal cancer and lymphoma[J]. Br J Cancer,1999, 81(6): 1009-1016.

[6]MARTEN A, RENOTH S, VON LILIENFELD-TOAL M, et al.Enhanced lytic activity of cytokine-induced killer cells against multiple myeloma cells after co-culture with idiotype-pulsed dendritic cells[J]. Haematologica, 2001, 86(10): 1029-1037.