張 歆 ,張林波,田見暉*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院生物制藥創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193)

體細(xì)胞核移植(SCNT)，又稱體細(xì)胞克隆。作為動(dòng)物細(xì)胞工程技術(shù)的常用手段，即把體細(xì)胞移入去核卵母細(xì)胞中，使其重組并能發(fā)育成新的胚胎，最終發(fā)育成個(gè)體。其過程主要包括：卵母細(xì)胞體外成熟即發(fā)育至第2次減數(shù)分裂中期(MⅡ期)，脫去顆粒細(xì)胞后將供體細(xì)胞注入去核的卵母細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過電融合、化學(xué)激活和后期培養(yǎng)發(fā)育到相應(yīng)的時(shí)期后移植到受體內(nèi)直至妊娠。進(jìn)行豬的克隆研究最重要的意義在于進(jìn)行異種器官移植，生產(chǎn)無免疫排斥反應(yīng)的轉(zhuǎn)基因豬，將其器官應(yīng)用于人類臨床醫(yī)學(xué)的相關(guān)研究，因而具有巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬首先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)?，篩選穩(wěn)定整合外源基因的陽性轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，然后將轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中生產(chǎn)重構(gòu)胚胎，經(jīng)移植到母體中發(fā)育產(chǎn)生仔畜[1]。盡管有很多體細(xì)胞核移植的克隆豬出生，也做了許多技術(shù)上的改進(jìn)，但是總的效率還是很低。影響轉(zhuǎn)基因克隆效率的因素很多，包括卵母細(xì)胞的成熟液成分及培養(yǎng)時(shí)間，去核和融合方法，供體細(xì)胞的類型、周期，及供體核進(jìn)入卵母細(xì)胞后的重編程過程等。近些年來許多研究者都致力于對(duì)提高克隆效率的研究。本文將從三方面對(duì)克隆效率的影響及近年來在這幾方面的成果進(jìn)行綜述，即在卵母細(xì)胞的成熟、去核和后期發(fā)育過程中添加化學(xué)成分對(duì)體細(xì)胞核移植效率的影響。

1 在成熟液中添加化學(xué)成分對(duì)SCNT的作用

卵母細(xì)胞的成熟是胚胎體外生產(chǎn)體系的一個(gè)非常關(guān)鍵的步驟，它影響著卵母細(xì)胞的發(fā)育能力和質(zhì)量，進(jìn)而直接影響胚胎的發(fā)育，甚至是后代幼仔的健康[2]。和體內(nèi)的成熟相比，體外發(fā)育的能力還是很低的，因此，提高SCNT的效率必須對(duì)成熟培養(yǎng)液進(jìn)行優(yōu)化。

1.1 成熟液體系在各國家的應(yīng)用情況

關(guān)于卵母細(xì)胞的成熟很多人用的是兩步成熟過程，第1步是卵丘卵母細(xì)胞在含有激素的成熟液中培養(yǎng)20～22 h，比如添加eCG和hCG來促進(jìn)核成熟；第2步使卵丘卵母細(xì)胞在不含有激素的成熟液中培養(yǎng)18～24 h，移除激素是為了減慢核成熟提高細(xì)胞質(zhì)的成熟。比較了卵母細(xì)胞的成熟體系之后，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)實(shí)驗(yàn)室都在用北卡羅來納州大學(xué)的培養(yǎng)液(NCSU-23)，添加10%的豬卵泡液作為基本的成熟培養(yǎng)液，有4個(gè)實(shí)驗(yàn)室用NCSU37+10%豬卵泡液，5個(gè)利用TCM199+10%PFF，有1個(gè)用TCM199添加0.1%PVA。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)液還另外添加了許多不同成分，如半胱氨酸、EGF、dbcAMP、胰島素和氨基酸等[3]。

1.2 成熟液中添加leptin等物質(zhì)對(duì)SCNT的影響

體外成熟的卵母細(xì)胞受諸多因素的影響，包括成熟時(shí)間、溫度、相關(guān)的細(xì)胞因子等[4]。在這些因素中，補(bǔ)充細(xì)胞因子在卵母細(xì)胞核質(zhì)成熟中起著重要作用[5]。研究者發(fā)現(xiàn)，在小鼠的卵母細(xì)胞卵泡發(fā)育的各個(gè)階段和卵母細(xì)胞成熟過程中都發(fā)現(xiàn)有l(wèi)eptin的高表達(dá)，推測可能與卵母細(xì)胞的成熟有關(guān)。向豬卵母細(xì)胞的成熟液中添加leptin，最終發(fā)現(xiàn)可以提高孤雌發(fā)育和SCNT胚胎的發(fā)育能力，而且具有劑量依賴性。研究還發(fā)現(xiàn)，leptin是通過MAPK通路來促進(jìn)核與質(zhì)的成熟[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，核移植的顯微操作過程中，leptin處理組和對(duì)照組相比，在融合和激活之后卵母細(xì)胞的死亡率都會(huì)降低[7]。在最近一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中提到，銨可以影響核和質(zhì)的成熟，尤其是谷氨酰胺，能夠產(chǎn)生銨離子，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。若將IVM液中的谷氨酰胺換成丙酰胺基谷酰胺或者甘氨?；弱０肪涂梢詼p少銨的累積，保護(hù)卵母細(xì)胞不受銨的破壞，順利完成減數(shù)分裂和后期的發(fā)育[8]。據(jù)Guo-Shi Liu報(bào)道，褪黑素在卵泡液中的濃度大約是10-11mol/L，這就說明褪黑素在卵母細(xì)胞成熟過程中起著重要作用。作者在成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度褪黑素，結(jié)果囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)均高于對(duì)照組[9]。而在另外一項(xiàng)報(bào)道中也有類似的結(jié)果，只是細(xì)胞數(shù)一項(xiàng)沒有提高[10]。諸多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，褪黑素是一種直接作用的抗氧化劑，具有強(qiáng)烈清除活性氧的作用[11]，有助于提高SCNT效率。

表1 各國家之間生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因豬其成熟培養(yǎng)液使用情況比較

2 去核方法對(duì)SCNT效率的影響

2.1 物理去核

利用胞質(zhì)體作為核移植的受體首先就要清除卵母細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)，這樣就必須先確定卵母細(xì)胞核的位置。通常所用的方法是盲吸法，就是以第1極體作為標(biāo)記來確定MⅡ期卵母細(xì)胞紡錘體的位置，吸掉整個(gè)極體和極體下面很少的一部分胞質(zhì)。但是許多情況下赤道板和第1極體不在相鄰的位置上[12]，這種現(xiàn)象在牛和兔上也有報(bào)道。實(shí)驗(yàn)指出只有50%的紡錘體存在于第1極體附近，甚至更少[13]。為了提高去核率，第1極體下面有時(shí)有1/3的胞質(zhì)被吸走，這樣大量地去除胞質(zhì)可能會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因核重排能力的下降甚至發(fā)育不完全。而且，若在卵母細(xì)胞成熟之前即脫掉顆粒細(xì)胞，這樣會(huì)破壞第1極體和MⅡ期紡錘體的相互作用，導(dǎo)致在去核之后仍有遺傳物質(zhì)的殘留[14]。還有許多物理去核方法，諸如在卵母細(xì)胞成熟的不同時(shí)期進(jìn)行去核等[15-17]，對(duì)后期發(fā)育都存在不同程度的影響。

2.2 化學(xué)去核

化學(xué)去核就是使用化學(xué)藥物進(jìn)行處理來輔助移除卵母細(xì)胞的染色體。利用細(xì)胞骨架修飾因子，如細(xì)胞松弛素B、秋水仙胺和nocodazole可以改變重構(gòu)胚胎中DNA內(nèi)含物的結(jié)構(gòu)和功能。秋水仙素是一種微管解聚劑，可以有效地誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的去核過程。而且，在激活之后用秋水仙素處理可以使豬的轉(zhuǎn)基因胚胎完整地發(fā)育，誘導(dǎo)單個(gè)的前核形成并提高DNA的倍性[18]。和秋水仙素相似，nocodazole可以成功地進(jìn)行輔助去核過程，它能夠穩(wěn)定中期赤道板，產(chǎn)生1個(gè)小的突起，使染色質(zhì)更為明顯，容易去除[19]。nocodazole的去核作用使人們開始嘗試?yán)没瘜W(xué)輔助去核方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆豬。在研究的早期有人應(yīng)用etoposide，或者etoposide和放線菌酮的復(fù)合體，或者乙醇和秋水仙胺。但是此種化學(xué)處理方法和常規(guī)的去核方法相比，卵裂率和后期發(fā)育率均很低[20]。

2.3 其他的去核方法

用3%的蔗糖處理小鼠的卵母細(xì)胞會(huì)使其在光學(xué)顯微鏡下出現(xiàn)更多的半透明部分，更容易觀察減數(shù)分裂的紡錘體形態(tài)[21]。還有人報(bào)道說，POL-scope系統(tǒng)可以使紡錘體的定位觀察更加直觀，但是這種儀器非常昂貴，在不同的品種之間還需要多重復(fù)合[22]。如果把牛的卵母細(xì)胞離心然后結(jié)合CB的處理，去核后也有發(fā)育能力，但是這種方法必須移除透明帶，這可能會(huì)阻礙到后期的進(jìn)一步發(fā)育[23]。

3 在胚胎發(fā)育液中添加物質(zhì)對(duì)SCNT效率的影響

3.1 CSF2

有一系列的論據(jù)可以證明，CSF2在早期胚胎發(fā)育過程中作為一個(gè)生理學(xué)重要的調(diào)節(jié)器而發(fā)揮作用。在腔上皮組織和輸卵管以及子宮內(nèi)膜組織中有表達(dá)[24,25]。CSF2在胚胎發(fā)育過程中作為一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子可以提高克隆胚胎的耐受性，在移植之后可以提高囊胚率和妊娠率。其原因一方面可能是CSF2可以促進(jìn)有絲分裂，增加胚胎的細(xì)胞數(shù)，充分地促進(jìn)囊胚腔的形成。另一方面，CSF2通過阻斷細(xì)胞凋亡來增加細(xì)胞數(shù)。通過觀察，CSF2處理的卵母細(xì)胞有相當(dāng)數(shù)量的與外滋養(yǎng)層有關(guān)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)，表明CSF2影響著囊胚的分化[26]。此結(jié)論在人和小鼠上都有過驗(yàn)證。

3.2 TSA(組蛋白脫乙?；敢种苿?

目前認(rèn)為：供體核的不完全重編程是導(dǎo)致克隆效率低的主要原因。關(guān)于供體核的重編程，其研究主要集中在DNA甲基化和組蛋白乙酰化。組蛋白的乙酰化發(fā)生在核心組蛋白的賴氨酸殘基上[27]。核心組蛋白在MⅠ期高度乙?；?，然后立刻去乙酰化，在MⅡ期大多數(shù)的核心組蛋白賴氨酸位點(diǎn)都去乙酰化，除了H4K8位點(diǎn)[28]。體細(xì)胞基因組中核心組蛋白的乙?；袃煞N，第1種發(fā)生在組蛋白H3K4的3個(gè)賴氨酸位點(diǎn)上，在體細(xì)胞核移植之后立刻發(fā)生去乙酰化，3 h后完全去乙酰化。卵母細(xì)胞激活之后在這些位點(diǎn)上發(fā)生再次乙酰化。在SCNT過程中這種組蛋白賴氨酸位點(diǎn)的去乙?；椭匦乱阴；^程對(duì)克隆胚胎的基因表達(dá)和全能性的建立是非常關(guān)鍵的，也直接影響著克隆效率。

最近的一項(xiàng)研究表明，提高供體細(xì)胞或者克隆胚胎中組蛋白的乙?；娇梢源龠M(jìn)發(fā)育從而提高效率[29]。用一種組蛋白脫乙?；敢种苿┨幚砼５奶撼衫w維細(xì)胞可以提高克隆胚胎的發(fā)育[30]。另一種組蛋白脫乙?；敢种苿㏕SA，可以提高克隆效率，在牛和小鼠上都已經(jīng)有過驗(yàn)證[31,32]。在2009年，也有研究表示，TSA處理可以提高克隆胚胎基因組的乙酰化水平，在很多物種中都提高了后期發(fā)育能力[33]。而且TSA處理的兔SCNT胚胎的組蛋白乙?；潭缺任刺幚斫M要高。這種現(xiàn)象在TSA處理的小鼠SCNT胚胎中也得到了驗(yàn)證[32]。在豬的手工克隆中也有TSA的應(yīng)用，而且可以很顯著地提高發(fā)育能力，并順利完成整個(gè)發(fā)育過程[34]。但是在同年，據(jù)Meng報(bào)道，用TSA處理兔子的SCNT胚胎，限制了其后期發(fā)育的能力，沒有提高囊胚率，處理和未處理組均有后代產(chǎn)生，但是TSA處理組沒有發(fā)育到成年[29]?？赡艿脑蚓褪?，在不同的物種中體細(xì)胞核移植操作的差異導(dǎo)致了不同的結(jié)果。在現(xiàn)在的研究中，人們?cè)噲D篩選TSA處理合適的時(shí)間及濃度，這就需要正確的SCNT操作方法，TSA適當(dāng)?shù)奶幚硪约疤禺惖奈锓N之間成功的結(jié)合才能夠最終達(dá)到提高轉(zhuǎn)基因效率的目的。

3.3 褪黑素

機(jī)體在有氧代謝過程中產(chǎn)生的活性氧族(ROS)對(duì)大多數(shù)細(xì)胞都具有毒性作用。當(dāng)ROS產(chǎn)生增多或者機(jī)體清除能力下降時(shí)機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)氧化應(yīng)激。為了阻止機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激，在培養(yǎng)介質(zhì)中添加抗氧化劑或者自由基清除劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以有效地提高胚胎的發(fā)育能力。褪黑素，又名N-乙酰-5-氧基色胺，是有效的自由基清除劑和抗氧化劑[35]。和其他已知的自由基清除劑相比，褪黑素具有多功能性而且比較普遍。它作為一種既疏水又親水的復(fù)合溶液，可以溶解在水中和類脂中，說明褪黑素和它的代謝產(chǎn)物可以直接清除羥基自由基、烴氧基、過氧化氫根、亞硝酸鹽陰離子、氧化亞氮和單獨(dú)的氧，而且，褪黑素還能夠修復(fù)被氧化的分子，抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等[36]。有報(bào)道說，褪黑素還可以提高小鼠的囊胚發(fā)育率[37]。通過毒性試驗(yàn)驗(yàn)證，在小鼠和兔子的胚胎發(fā)育上無論在體內(nèi)還是體外組均無毒害作用。據(jù)Yuichi ro Kitagawa報(bào)道，在低氧條件下，豬卵母細(xì)胞體外發(fā)育過程中可以減少過氧化氫含量，從而減少了DNA斷裂的發(fā)生，提高了胚胎的發(fā)育能力[38]。Krzysztof Papis等人還做了進(jìn)一步的研究，發(fā)現(xiàn)在20%高氧條件下添加褪黑素可以促進(jìn)發(fā)育，在7%低氧條件下反而會(huì)抑制發(fā)育，這是否說明褪黑素在低氧條件下產(chǎn)生了副作用，或者影響了乙酰化過程還需要進(jìn)一步驗(yàn)證[39]。

3.4 nocodazole

nocodazole是一種細(xì)胞骨架修飾因子。若將細(xì)胞支架的修飾因子注入到SCNT的卵母細(xì)胞中，可以影響核的重塑，抑制由于阻斷微管的解聚而導(dǎo)致的同源染色體的丟失，提高DNA的倍性和SCNT的發(fā)育。核的重排和保持核的倍性是轉(zhuǎn)基因胚胎發(fā)育的必要條件。在目前國內(nèi)的研究中，已經(jīng)驗(yàn)證了nocodazole的作用，它是一種細(xì)胞骨架修飾因子，可改變供體核的形態(tài)，引入已經(jīng)去核的卵母細(xì)胞中從而影響豬轉(zhuǎn)基因胚胎的后期發(fā)育。結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞激活之后用nocodazole處理可以提高單核的形成率，通過排出極體來抑制DNA的丟失，從而保證了核的倍性。nocodazole處理可以使轉(zhuǎn)基因胚胎完成完整的發(fā)育過程，但是幼仔的形成率一項(xiàng)和對(duì)照組相比沒有明顯的差異[40]。在先前許多研究中都發(fā)現(xiàn)，無論是孤雌胚胎還是轉(zhuǎn)基因胚胎中，細(xì)胞骨架修飾因子如秋水仙胺和細(xì)胞松弛素B都可以保留核的遺傳信息，這很可能影響了微管的組裝[41]。

4 結(jié)語

在卵母細(xì)胞成熟、去核以及后期發(fā)育過程中添加化學(xué)物質(zhì)，均不同程度地提高了核移植的效率，但傳統(tǒng)的添加實(shí)驗(yàn)基于經(jīng)驗(yàn)式的摸索，具有盲目性和不可重復(fù)性，而且效率低下。近些年研究表明，體細(xì)胞核重編程的不完全是克隆胚胎發(fā)育效率低下的重要原因，雖然已有個(gè)別實(shí)驗(yàn)室通過添加組蛋白去乙酰化酶抑制劑等藥物來提高克隆胚胎的發(fā)育能力，但進(jìn)展緩慢。因此，采用表觀遺傳學(xué)研究的相關(guān)手段，解析克隆胚胎發(fā)育過程中體細(xì)胞核的重編程過程將是未來克隆技術(shù)研究的一個(gè)重要方面。此類研究對(duì)于改進(jìn)體細(xì)胞核移植技術(shù)，保證克隆胚胎的安全性具有重大的意義。

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