南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院內(nèi)分泌科 (廣州 510282)

戴亞麗 蔡德鴻* 陳 宏 張 振 張 樺 李 靜

腫瘤的發(fā)生與原癌基因激活和抑癌基因失活,并最終引起基因表達(dá)異常有關(guān)?；虮磉_(dá)異?？赡芡ㄟ^基因機(jī)制(Genetic mechanism)和表基因機(jī)制(Epigenetic mechanism)[1]來完成。 DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾,對維持染色體的結(jié)構(gòu)、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發(fā)生發(fā)展都起重要的作用,主要發(fā)生在啟動子區(qū) CpG位點[2]。正常組織的腫瘤抑癌基因不發(fā)生甲基化,當(dāng)腫瘤抑癌基因發(fā)生甲基化后,就不能正常轉(zhuǎn)錄、翻譯合成抑癌蛋白及發(fā)揮抑癌作用,細(xì)胞就有可能發(fā)生單克隆增生形成腫瘤。

乳頭狀甲狀腺癌(Papillary thyroid carcinoma,PTC)是甲狀腺最常見的惡性腫瘤,目前國外有研究報道甲狀腺癌的發(fā)生也與抑癌基因啟動子甲基化的發(fā)生密切相關(guān)[3],本研究選擇了兩種抑癌基因:促甲狀腺激素受體(Thyroid stimulating hormone receptor,T SHR)和 RASSF1A基因,采用甲基化特異性 PCR(Methylation-specific PCR,M SP)法 ,對 PTC及對照組織進(jìn)行研究,來探討 PTC的發(fā)生機(jī)制。

對象和方法

1 研究對象 研究組為我院甲乳外科 2007～2009年收治的 50例 PTC患者(PTC組),男 15例,女35例,平均年齡 (40± 12)歲;對照組為我院甲乳外科同期收治的 32例良性甲狀腺腫瘤患者,其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫 20例,甲狀腺腺瘤 12例;男 9例,女 23例,平均年齡(37±12)歲。兩組均為新鮮手術(shù)標(biāo)本,經(jīng)病理檢查確診,標(biāo)本切除后迅速轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存。

2 方 法

2.1 組織 DNA的提取:使用 QIAamp DNA Mini Kits 51304基因組提取試劑盒(美國 Qiagen公司)按說明書提取基因組 DNA,紫外分光光度儀檢測其含量和純度。

2.2 DNA甲基化修飾:使用 Cp GenomeTMDNA Modification Kit S7820(CHEMICON公司 )試劑盒對提取的 DNA進(jìn)行亞硫酸氫鈉處理和純化。

2.3 甲基化特異性 PCR(MSP)擴(kuò)增:兩種抑癌基因的甲基化引物與非甲基化引物序列參照文獻(xiàn)[4,5],見表 1,由上海生工公司合成。 PCR反應(yīng)體系 25 μ l,上下游引物各 1 μ l(10pmol/μ l),甲基化修飾后的 DNA 2 μ l,所 用 試 劑 盒 為 2× PCR master mix K0171(Fermentas公司)。 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

兩種抑癌基因 PCR(甲基化與非甲基化)擴(kuò)增條件:95℃預(yù)變性 5min,95℃變性 30s,65℃(TSHR基因)/60℃(RASSF1A基因 )退火 30s,72℃延伸 30s,循環(huán) 30個周期,最后 72℃延伸 5min。

2.4 抑癌基因克隆及測序:每個抑癌基因各隨機(jī)選取 2例 PTC及 2例對照組織(均包含甲基化標(biāo)本及未甲基化標(biāo)本各 1例),首先進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,克隆后再測序。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法:采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件,以Pearsoni2檢驗分析兩個抑癌基因 PTC組與對照組間甲基化差別;PTC組 TSHR與 RASSF1A基因甲基化的相關(guān)性用 Spearman相關(guān)分析;以 Pearsoni2檢驗分析 PTC組兩個抑癌基因啟動子甲基化和主要的臨床病理參數(shù)的關(guān)系,P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 PCR所用引物序列及片段大小

結(jié) 果

1 兩種抑癌基因啟動子甲基化分析:PTC患者中,發(fā)現(xiàn) 34/50例(68.0%)TSHR基因、30/50例(60.0%)RASSF1A基因啟動子發(fā)生了甲基化;對照組患者中,7/32例(21.9%)TSHR基因、10/32例(31.3%)RASSF1A基因啟動子發(fā)生甲基化;PTC組 TSHR基因和 RASSF1A基因啟動子甲基化率均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)(圖 1,2)。

圖1 TSHR基因啟動子 M SP電泳圖(Marker:100bp DN A標(biāo)記物,K、L:PTC組,Y、W:對照組,U:非甲基化條帶,M:甲基化條帶)

圖2 RASSF1A基因啟動子 M SP電泳圖(Marker:100 bp DN A標(biāo)記物,K、L、M、N、O、Q:乳頭狀甲狀腺癌,上排 U、Y、Z:對照組織標(biāo)本,下排 U:非甲基化條帶,M:甲基化條帶)

圖3 測序圖(TSHR基因啟動子甲基化者 CpG島中的 C仍為 C,未甲基化者 C均轉(zhuǎn)變?yōu)?T)

2 測序結(jié)果:兩個基因啟動子發(fā)生了甲基化的,其所有 CpG位點堿基均發(fā)生了改變,即甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物中的 CpG位點的 C仍然保持 C,而非甲基化引物擴(kuò)增產(chǎn)物中的 CpG位點中的 C轉(zhuǎn)變?yōu)?T(圖 3,4)。

3 PTC組 TSHR和 RASSF1A基因甲基化間的關(guān)系:PTC組織中 TSHR和 RASSF1A基因啟動子均甲基化的為 26/50;TSHR甲基化而 RASSF1A基因未甲基化的為 8/50;TSHR未甲基化而 RASSF1A基因甲基化的為 4/50;TSHR和 RASSF1A基因啟動子均未甲基化的為 12/50。計算 r=0.490(P=0.000),提示 PTC組 TSHR和 RASSF1A兩個抑癌基因甲基化之間存在顯著相關(guān)性。

4 兩個抑癌基因甲基化與患者臨床病理資料之間的關(guān)系:結(jié)合患者的臨床病理資料,TSHR和RASSF1A基因甲基化與患者的年齡、性別、臨床分期均未見相關(guān)性;TSHR基因與患者是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),RASSF1A基因與患者是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān) ,見表 2。

圖4 測序圖(RASSF1A基因啟動子甲基化者 CpG島中的 C仍為 C,未甲基化者 C均轉(zhuǎn)變?yōu)?T)

表2 兩個抑癌基因啟動子甲基化和主要臨床病理參數(shù)的關(guān)系

討 論

表基因機(jī)制主要指 DNA 5’CpG島胞嘧啶甲基化改變[1],引起基因表達(dá)異常。腫瘤中 DNA甲基化異常表現(xiàn)為基因中散在的 CpG位點甲基化普遍下降和區(qū)域性 CpG島高甲基化并存及細(xì)胞總的甲基化能力升高。目前人們已在多種腫瘤(乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、腎癌、鼻咽癌等)的發(fā)生中證實抑癌基因啟動子區(qū)的甲基化與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6],有關(guān)甲狀腺腫瘤與抑癌基因甲基化的關(guān)系,國外也有相關(guān)報道。

Jason等[5]對 32例 PTC患者和 27例對照組采用MSP方法進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn) T SHR在癌組織的甲基化率為 34%,在對照組中為 7%,兩者存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異,并且在甲狀腺癌組發(fā)現(xiàn)了 TSHR甲基化的腫瘤復(fù)發(fā)率高,未發(fā)生甲基化的腫瘤復(fù)發(fā)率低,他們認(rèn)為抑癌基因啟動子區(qū)的甲基化是甲狀腺癌的一個惡性標(biāo)記。Schagdarsurengin等[7]采用 MSP法 ,對 13例 PTC,10例濾泡型甲狀腺癌,9例未分化甲狀腺癌,6例髓樣甲狀腺癌,12例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及 10例濾泡型腺瘤進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn) PTC患者 TSHR啟動子甲基化率為58%,未分化甲狀腺癌為 86%,而在對照組達(dá)到 80%,T SHR啟動子甲基化率僅在未分化癌中較其他甲狀腺癌高。唐建東[8]等用 M SP法在 PTC組織中發(fā)現(xiàn)RASSF1A基因啟動子甲基化的發(fā)生率為 55.9%(19/34),癌旁組織中甲基化的發(fā)生率為 23.5%(8/34),認(rèn)為甲基化可能與 PTC發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

我們使用 MSP法,檢測了 50例 PTC和 32例對照 TSHR和 RASSF1A基因啟動子甲基化情況,發(fā)現(xiàn)了兩種抑癌基因啟動子的甲基化頻率在 PTC中明顯高于對照組(P＜0.05);測序結(jié)果證實了兩個基因啟動子 CpG島的所有 CpG位點均發(fā)生了甲基化。有研究發(fā)現(xiàn)多個抑癌基因啟動子甲基化在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有協(xié)同作用,多個抑癌基因甲基化對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響可能較單一基因甲基化更為重要[5]。我們進(jìn)一步對兩種抑癌基因甲基化之間相關(guān)性進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)T SHR和 RASSF1A之間存在關(guān)聯(lián)性,這可能是由于兩種抑癌基因的作用環(huán)節(jié)相同:TSHR基因和RASSF1A基因都主要作用于信號傳導(dǎo)[9]。 PTC組兩種抑癌基因啟動子甲基化,均與腫瘤的臨床分期無關(guān),提示兩種抑癌基因啟動子甲基化可能在甲狀腺腫瘤的早期階段既已發(fā)生;但 TSHR基因啟動子甲基化率在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的 PTC高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病例,提示該抑癌基因啟動子甲基化在甲狀腺癌的惡性進(jìn)展中可能發(fā)揮一定作用。僅從我們的研究結(jié)果表明,在 PTC中兩種抑癌基因啟動子的高甲基化可能抑制了抑癌基因的表達(dá),使得抑癌基因?qū)?PTC的抑制作用減少,從而促進(jìn)了 PTC的發(fā)生和發(fā)展,另 TSHR基因和RASSF1A基因在 PTC的發(fā)生中可能起到協(xié)同作用。因此,我們的研究提供了證據(jù):在 PTC中異常的抑癌基因啟動子甲基化可能是抑癌基因沉寂的一個重要機(jī)制。

總之,我們在 PTC的研究顯示了 TSHR和RASSF1A兩種基因異常的甲基化在 PTC中是一種較普遍的現(xiàn)象,可能是基因沉寂的一個潛在分子通路,與 PTC的發(fā)生、發(fā)展有一定聯(lián)系。雖然 DNA甲基化是一個復(fù)雜的過程,許多細(xì)節(jié)尚未明了,但隨著對這一領(lǐng)域研究的深入以及對于腫瘤發(fā)生機(jī)制的逐漸明釋,我們相信它對于腫瘤早期預(yù)測與干預(yù)以及預(yù)后評估等將會有重要作用。

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