楊宇清，鄭一敏，胡 楊，樂 亮，江 娟，王 寧，林海珠

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

隨著社會(huì)的進(jìn)步，人們?cè)絹碓阶非蠓奖?、快捷、安全、健康的食品，但是食品在加工、?chǔ)藏過程中很容易受到細(xì)菌、霉菌、酵母的污染，導(dǎo)致腐敗變質(zhì)，因此，研發(fā)安全、有效的食品防腐劑，是食品工業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵問題之一［1］?？莶菅挎邨U菌在自然界中廣泛存在，對(duì)人畜無害，且不污染環(huán)境，具有極好的抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力［2－3］，其代謝產(chǎn)物具有極高利用價(jià)值和開發(fā)前景［4］。本文以一株本實(shí)驗(yàn)室分離得到的具有很強(qiáng)拮抗作用的枯草芽孢桿菌為研究對(duì)象，對(duì)其搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為該菌種規(guī)模化發(fā)酵提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

1.1.1 菌種

供試菌株:枯草芽孢桿菌3－2(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院天然藥物實(shí)驗(yàn)室保藏);指示菌株:大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院天然藥物實(shí)驗(yàn)室保藏)。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子液體培養(yǎng)基:酵母膏 5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為7.0 ～7.2;種子固體培養(yǎng)基:在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%瓊脂粉;指示菌培養(yǎng)基:同種子培養(yǎng)基。

1.2 發(fā)酵液的制備

保存菌種經(jīng)活化后從斜面上挑取一環(huán)接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的100 mL的三角瓶中，37℃ 下180 r/min搖床培養(yǎng)12 h，制得種子液。以5%接種量將種子液接種到裝有200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL的三角瓶中，37℃下180 r/min搖床培養(yǎng)24 h制得發(fā)酵液。

1.3 指示菌懸液的制備［5］

保存菌種經(jīng)活化后從斜面上挑取一環(huán)接種于裝有30 mL種子培養(yǎng)基的100 mL的三角瓶中，37℃ 下180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，制得菌懸液.用10倍稀釋法將菌液稀釋、計(jì)數(shù)，求得菌懸液濃度，稀釋成106～107mL－1保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 活性評(píng)價(jià)方法－瓊脂擴(kuò)散法［6］

發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心10 min收集上清液，再經(jīng)0.22 μm過濾膜過濾除菌，即制得抗菌粗提液。取上述指示菌菌懸液200 μL與15 mL固體培養(yǎng)基混勻倒平板，待培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子放入吸有抗菌初提液500 μL的自制海綿圈，37℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈直徑，重復(fù)3次。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

選取下述5種常用的細(xì)菌培養(yǎng)基作為供試菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，篩選最適發(fā)酵培養(yǎng)基，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。培養(yǎng)基如下:

1)LB 培養(yǎng)基:酵母膏 5.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0 ～7.2。

2)NB 培養(yǎng)基:牛肉膏 3.0 g，蛋白胨 5.0 g，葡萄糖 2.5 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0。

3)BPY 培養(yǎng)基:葡萄糖 10.0 g，蛋白胨 10.0 g，酵母膏 5.0 g，牛肉膏 5.0 g，NaCl 5.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0。

4)Landy培養(yǎng)基:葡萄糖 20.0 g，L－谷氨酸5.0 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，KH2PO41.0 g，F(xiàn)eSO4·6H2O 0.15 mg，MnS04·H2O 5.0 mg，CuSO4·5H2O 0.1 6mg，蒸餾水1 000 mL，pH 值為7.0。

5)NYD 培養(yǎng)基:牛肉膏 8.0 g，酵母膏 5.0 g，葡萄糖 1.0 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為7.0。

1.5.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

采用最適發(fā)酵培養(yǎng)基，按本文1.2節(jié)方法制備發(fā)酵液，每隔4 h取樣，按本文1.4節(jié)方法測(cè)定發(fā)酵液的抑菌活性，考察培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響，重復(fù)3次。

1.5.3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

分別在28、30、32、35、37、40 ℃條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)條件按本文1.5.2節(jié)優(yōu)化后條件，并按本文1.4節(jié)方法測(cè)定各發(fā)酵液抑菌活性，考察溫度對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響，重復(fù)3次。

1.5.4 初始pH對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

以最適發(fā)酵培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH 分別調(diào)節(jié) pH 值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 和8.5，培養(yǎng)條件按本文 1.5.3 節(jié)優(yōu)化后條件，并照本文1.4節(jié)方法測(cè)定各發(fā)酵液抑菌活性，考察培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響，重復(fù)3次。

1.5.5 裝液量對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

在500 mL三角瓶中分別裝入體積為50、100、150、200、250的最適發(fā)酵培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為本文1.5.4節(jié)優(yōu)化后條件，并按本文1.4節(jié)方法測(cè)定各發(fā)酵液抑菌活性，考察裝液量對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響，重復(fù)3次。

1.5.6 接種量對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

按本文1.2方法制備種子液，分別以1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%、7.0% 和8.0%(v/v)的接種量接種，培養(yǎng)條件按本文1.5.5節(jié)，并按本文1.4節(jié)方法測(cè)定各發(fā)酵液抑菌活性，考察接種量對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響，重復(fù)3次。

1.5.7 接種齡對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

按本文1.2節(jié)方法制備種子液，分別取培養(yǎng)12、18、24、30和36 h的種子液接種于最適發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件按本文1.5.6節(jié)優(yōu)化后條件，并按本文1.4方法測(cè)定各發(fā)酵液抑菌活性，考察接種齡對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基篩選結(jié)果

5種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌活性的結(jié)果如表1所示。培養(yǎng)基的組分及含量對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響很大，BPY培養(yǎng)基的發(fā)酵液抑菌活性最高，而其他4種培養(yǎng)基的發(fā)酵液抑菌活性都較低，因此，選擇BPY培養(yǎng)基作為供試菌種的最適發(fā)酵培養(yǎng)基。

表1 不同培養(yǎng)基發(fā)酵液抑菌活性測(cè)定結(jié)果

2.2 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株3－2產(chǎn)細(xì)菌素的影響的試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，發(fā)酵4～8 h已經(jīng)有細(xì)菌素產(chǎn)生。24 h后，發(fā)酵液的活性已達(dá)到最高。延長(zhǎng)發(fā)酵時(shí)間活性無明顯變化，且發(fā)酵液對(duì)兩種指示菌的抑菌效果的趨勢(shì)相相似，所以選擇24 h作為發(fā)酵終點(diǎn)。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

對(duì)3－2菌株產(chǎn)細(xì)菌素的影響的試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。隨著溫度的升高，發(fā)酵液的抑菌活性逐漸增強(qiáng)，35℃時(shí)活性最強(qiáng)。溫度繼續(xù)升高，活性開始下降。當(dāng)溫度升至40℃，發(fā)酵液活性已經(jīng)很弱，所以選用35℃作為最適發(fā)酵溫度。

2.4 初始pH值對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

初始pH對(duì)菌株3－2產(chǎn)細(xì)菌素的影響的試驗(yàn)結(jié)果如表3所示。pH值在5.5～8.0內(nèi)菌株均能產(chǎn)細(xì)菌素，以pH值為7.0時(shí)活性最強(qiáng)，pH 值為5.0和8.5時(shí)無抑菌活性(細(xì)菌可以在這2個(gè)pH值條件下生長(zhǎng)，數(shù)據(jù)本文沒列出)，所以確定最適初始pH 值為7.0。

表2 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

表3 初始pH對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

2.5 裝液量對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

裝液量對(duì)菌株3－2產(chǎn)細(xì)菌素的影響的試驗(yàn)結(jié)果如表4所示。當(dāng)裝樣量達(dá)到100 mL后隨著裝液量的增大，抑菌活性呈下降趨勢(shì)，所以確定最適裝樣量為100 mL/500 mL。

表4 裝液量對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

2.6 接種量對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

接種量對(duì)3－2菌株產(chǎn)細(xì)菌素的影響的試驗(yàn)結(jié)果如表5所示，當(dāng)接種量為3%后，發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)，繼續(xù)增大接種量，發(fā)酵液活性無顯著變化，考慮實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)性，選用3%作為最佳接種量。

表5 接種量對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

2.7 接種齡對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

接種齡對(duì)3－2菌株產(chǎn)細(xì)菌素的影響的試驗(yàn)結(jié)果如表6所示。菌株產(chǎn)細(xì)菌素水平隨著接種齡的變化而變化，接種齡在12 h的發(fā)酵液抑菌活性最強(qiáng)，種齡超過12 h后，發(fā)酵液抑菌活性開始下降，所以選用12 h作為種子的發(fā)酵時(shí)間。

表6 接種齡對(duì)產(chǎn)細(xì)菌素的影響

3 討論

不同微生物生長(zhǎng)情況不同或合成的發(fā)酵產(chǎn)物不同，所需的培養(yǎng)基也就有所不同，但是對(duì)于所有發(fā)酵生產(chǎn)用的培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)也是存在某些共同點(diǎn)可供遵循的，即所有的發(fā)酵培養(yǎng)基都必須要有可以提供微生物生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)物合成所需要的碳、氮源、無機(jī)源、生長(zhǎng)因子和水等。對(duì)于大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)，除了考慮以上的微生物需要外，還必須考慮培養(yǎng)基原料的價(jià)格以及來源。對(duì)于3－2菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選，本試驗(yàn)通過搖瓶實(shí)驗(yàn)在5種基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上篩選最適的培養(yǎng)基，然后再在此最適的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果證明不同的培養(yǎng)基組分及配比對(duì)枯草芽孢桿菌3－2產(chǎn)細(xì)菌素有不同的影響，BPY為最適的培養(yǎng)基。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)菌素產(chǎn)量也相應(yīng)的增加，24 h時(shí)產(chǎn)量達(dá)到最大，繼續(xù)發(fā)酵產(chǎn)量沒有明顯增加，推測(cè)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也相應(yīng)的降低，阻礙了細(xì)菌素的進(jìn)一步產(chǎn)生。溫度對(duì)3－2產(chǎn)細(xì)菌素有明顯的影響，溫度過高或過低都不利于其產(chǎn)生細(xì)菌素。在中性環(huán)境中最易產(chǎn)生細(xì)菌素，通氣量對(duì)3－2產(chǎn)細(xì)菌素也有明顯的影響，通氣量過大或過低都不利于產(chǎn)生細(xì)菌素。接種量、種齡對(duì)其細(xì)菌素的產(chǎn)生有一定的影響。

枯草芽孢桿菌3－2生長(zhǎng)快，易產(chǎn)生細(xì)菌素，對(duì)革蘭氏陽性菌和陰性菌均具有很好的抑菌作用，是一株很有潛力開發(fā)用于天然防腐劑的菌株。本試驗(yàn)最終確定了3－2產(chǎn)細(xì)菌素的最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，為下一步的研究和開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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