藺慕會(huì) 何金婷 陳曉虹 徐忠信

(遼寧省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016)

IL-1β是IL-1家族中主要的活性分子〔1〕，在腦內(nèi)主要來(lái)源于小膠質(zhì)細(xì)胞〔2〕。在阿爾茨海默病(AD)患者腦中，IL-1β濃度增高與小膠質(zhì)細(xì)胞活化間有明顯相關(guān)性〔3〕，提示IL-1β、小膠質(zhì)細(xì)胞活化有可能參與了AD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。本研究選擇與神經(jīng)元生物學(xué)特性有很多相似之處的PC12細(xì)胞及已被廣泛用來(lái)體外培養(yǎng)并代替小膠質(zhì)細(xì)胞的BV2細(xì)胞共同培養(yǎng)，進(jìn)而探討由Aβ寡聚體預(yù)處理的BV2細(xì)胞對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響及IL-1β在此過(guò)程中的作用，來(lái)研究小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元損傷的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 PC12細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院北京細(xì)胞生物研究所，BV2細(xì)胞購(gòu)于上海復(fù)祥生物科技有限公司。細(xì)胞轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)購(gòu)于美國(guó)BD Falcon公司;RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)于 Gibco公司;Aβ1-42，六氟丙醇(HFIP)，抗 tau，tau(pS396)一抗、二抗購(gòu)于Sigma公司;MTT(噻唑藍(lán))購(gòu)于上海華舜生物工程有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)于美國(guó)PIERCE公司。Western印跡化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和小鼠IL-1βELISA試劑盒購(gòu)于武漢博士德公司;IL-1ra購(gòu)于R＆D系統(tǒng)(Minneapolis MN);IL-1β購(gòu)于Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組(Aβ+PC12組):PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Aβ1-42(0、10μmol/L)孵育24 h。實(shí)驗(yàn)組1(Aβ+BV2+PC12組):BV2 細(xì)胞經(jīng) Aβ1-42(0、1、5、10 μmol/L)預(yù)處理 24 h后檢測(cè)IL-1β，并選擇0、10μmol/L組與PC12細(xì)胞共育24 h。實(shí)驗(yàn)組 2(IL-1β +PC12 組):IL-1β(0、0.3、1、3、10 ng/ml)加入PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育24 h;實(shí)驗(yàn)組3〔(Aβ+BV2)+(PC12+IL-1ra)組〕:選擇 0、10 μmol/L組，預(yù)先用 IL-1ra(50 ng/ml)孵育PC12細(xì)胞1 h后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組1的細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 Aβ寡聚體的制備及細(xì)胞培養(yǎng) 按Klein WL(2002)方法制備Aβ1-42寡聚體〔4〕，用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 g/L鏈霉素)將PC12細(xì)胞培養(yǎng)在24孔培養(yǎng)板中。用DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)將BV2細(xì)胞培養(yǎng)在轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)上。在BV2細(xì)胞經(jīng)Aβ1-42處理24 h后，將培養(yǎng)液及生長(zhǎng)有BV2細(xì)胞的轉(zhuǎn)移篩網(wǎng)同時(shí)移入PC12細(xì)胞培養(yǎng)板與PC12細(xì)胞共育。

1.4 BV2細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β含量的檢測(cè) 不同濃度Aβ1-42(0、1、5、10 μmol/L)處理 BV2 細(xì)胞 24 h 后，收集培養(yǎng)液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)液中IL-1β的含量。以96孔酶標(biāo)計(jì)數(shù)儀檢測(cè)光密度值。根據(jù)對(duì)數(shù)公式，通過(guò)樣品OD值計(jì)算出IL-1β量。

1.5 Western印跡法檢測(cè)PC12細(xì)胞tau(pS396)、tau蛋白表達(dá)將蛋白裂解緩沖液(預(yù)冷至0℃)加入經(jīng)過(guò)漂洗的單層PC12細(xì)胞中，靜置20 min;用細(xì)胞刮棒收集細(xì)胞，用蛋白定量分析(BCA法)測(cè)定總蛋白濃度。加樣蛋白含量50μg，經(jīng)10%SDSPAGE電泳分離，4℃條件下轉(zhuǎn)膜，置膜于5%脫脂奶粉封閉1 h，在室溫下分別加入兔抗大鼠tau(pS396);tau一抗(1∶1 000)，4℃ 過(guò)夜，室溫下加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶4 000)，60 min;化學(xué)發(fā)光顯色，計(jì)算機(jī)掃描分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)以x±s表示，采用SPSS10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Aβ預(yù)處理的BV2細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β含量 Aβ寡聚體預(yù)處理的BV2細(xì)胞培養(yǎng)液中可檢測(cè)出IL-1β，隨著Aβ寡聚體濃度(0，1，5，10 μmol/L)的增加，IL-1β 含量也明顯增加〔(16.50 ±1.60)，(1 102.13 ±138.25)，(2 522 ±94.77)，(2 965 ±121.3)pg/ml〕(P ＜0.05)。

2.2 不同濃度IL-1β處理后PC12細(xì)胞tau(pS396)、tau蛋白表達(dá)情況 IL-1β(0.3、1、3、10 ng/ml)加入PC12細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育24 h后，可見(jiàn)PC12細(xì)胞tau(pS396)/總tau蛋白比值〔分別為(21.240±2.26)%、(27.775±1.103)%、(35.691±1.320)%、(38.836±1.530)%〕較未加入IL-1β組〔(11.201±2.171)%〕增多(P＜0.05)，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度IL-1β處理后PC12細(xì)胞tau(p S396)、tau蛋白表達(dá)結(jié)果

2.3 IL-1ra對(duì)PC12細(xì)胞tau(pS396)蛋白表達(dá)的影響 IL-1β(3 ng/ml)+ PC12 組 (35.691% ± 1.320%)，Aβ(10μmol/L)+BV2+PC12組，Aβ(10 μmol/L)+BV2+PC12+IL-1ra組tau表達(dá)(12.660% ±2.002%)無(wú)明顯變化;tau(pS396)/總tau比值 Aβ(10μmol/L)+PC12組(35.694% ±1.523%)，Aβ(10μmol/L)+BV2+PC12 組(49.504% ±3.146%)均明顯增加(P＜0.05)，后者與前者相比tau(pS396)表達(dá)進(jìn)一步增多(P＜0.05);Aβ(10μmol/L)+BV2+IL-1ra+PC12組(40.611% ±3.019%)與 Aβ(10μmol/L)+BV2+PC12組相比tau(pS396)表達(dá)有所減少(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組PC12細(xì)胞tau(pS396)、tau蛋白Western印跡表達(dá)結(jié)果

3 討論

IL-1β是IL-1家族的主要活性分子〔1〕，在成年后腦內(nèi)表達(dá)水平很低。但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、損傷等疾病后，IL-1含量顯著增加〔5〕。研究發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中IL-1β表達(dá)水平升高，其血清中的IL-1β也比正常老年人高出數(shù)倍，并且IL-1β多態(tài)性與AD的發(fā)病和進(jìn)展密切相關(guān)〔6〕。

表達(dá)P2X7受體的小膠質(zhì)細(xì)胞(MG)在Aβ作用下可分泌大量的IL-1β〔2〕，Griffin等1989年首次發(fā)現(xiàn)AD患者腦中 IL-1活性、MG數(shù)量較對(duì)照組增加約6倍，提示在AD患者腦中MG可能是IL-1的主要來(lái)源〔7〕。本研究首先用Aβ寡聚體公認(rèn)的AD致病因子作用于BV2細(xì)胞，排除其他因素干擾，發(fā)現(xiàn)BV2細(xì)胞能分泌較多IL-1β至培養(yǎng)液上清。并且Aβ寡聚體與BV2分泌的IL-1β有劑量相關(guān)性，提示Aβ寡聚體與BV2細(xì)胞合成、分泌IL-1β有因果關(guān)系，支持既往觀點(diǎn)。

IL-1β在AD中的作用有學(xué)者認(rèn)為起保護(hù)作用〔8〕，但多數(shù)認(rèn)為IL-1β參與AD發(fā)展的炎癥反應(yīng)中，處于反應(yīng)鏈的前端，可進(jìn)一步引起其他炎癥介質(zhì)如NO的增多，加重炎癥反應(yīng)〔9〕，還可以直接引起神經(jīng)元tau蛋白磷酸化及突觸損傷〔10〕。本研究提示IL-1β可導(dǎo)致tau蛋白異常磷酸化，從而導(dǎo)致細(xì)胞骨架形成障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡。

本研究結(jié)果提示 BV2細(xì)胞可促進(jìn) Aβ1-42寡聚體導(dǎo)致的PC12細(xì)胞tau(pS396)表達(dá)。為明確此作用是否與BV2細(xì)胞分泌IL-1β有關(guān)，本研究用IL-1ra預(yù)先處理PC12細(xì)胞，封閉PC12細(xì)胞IL-1β受體，IL-1受體拮抗蛋白(IL-1ra)在一級(jí)結(jié)構(gòu)與空間構(gòu)象上，與IL-1具有同源性，是IL-1的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，對(duì)IL-1α及IL-1β受體結(jié)合能力都很強(qiáng)，足以阻斷二者的功能〔11〕。本結(jié)果提示BV2細(xì)胞加重Aβ1-42寡聚體對(duì)PC12細(xì)胞的損傷與其分泌IL-1β有關(guān)。當(dāng)然，與對(duì)照組相比，IL-1ra并未完全拮抗BV2的損傷作用，因?yàn)锳β1-42寡聚體處理BV2細(xì)胞后必然有其他因子產(chǎn)生，參與BV2細(xì)胞加重對(duì)PC12細(xì)胞的損傷過(guò)程，這一點(diǎn)也在3 ng/ml IL-1β+PC12組與10μmol/L+BV2+PC12組比較中發(fā)現(xiàn)，雖然BV2細(xì)胞經(jīng)Aβ(10μmol/L)處理24 h后產(chǎn)生IL-1β約為3 ng/ml左右，但3 ng/ml IL-1β+PC12組蛋白比值卻低于Aβ(10μmol/L)+BV2+PC12組，雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但提示除了IL-1β外還有其他因素參與此過(guò)程。至于還有哪些因子參與還有待于進(jìn)一步研究。

本研究通過(guò)體外細(xì)胞培養(yǎng)研究證實(shí)，IL-1β通過(guò)引起tau異常磷酸化通路參與BV2細(xì)胞加重Aβ寡聚體對(duì)PC12細(xì)胞損傷過(guò)程，提示對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化及對(duì)其分泌的炎性介質(zhì)進(jìn)行干預(yù)，可能是治療AD的一條可行之路。但體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，是否通過(guò)阻斷AD病人IL-1β的作用，就能有助于阻止AD病情發(fā)展，還需進(jìn)一步探討。

1 Rothwell NJ，Luheshi GN.Interleukin-1 in the brain:biology，pathology and therapeutic target〔J〕.Trends Neurosci，2000;23(12):618-25.

2 Sanz JM，Paola Chiozzi，Davide Ferrari，et al.Activation of microglia by amyloid β requires P2X7 receptor expression〔J〕.J Immunol，2009;182(7):4378-85.

3 Eriksson C，Van Dam AM，Lucassen PJ，et al.Immunohistochemical localization of interleukin-1beta，interleukin-1 receptor antagonist and interleukin-1 beta converting enzyme/caspase-1 in the rat brain after peripheral administration of kainic acid〔J〕.Neuroscience，1999;93(3):915-30.

4 Klein WL.Abeta toxicity in Alzheimer's disease:globular oligomers(ADDLs)as new vaccine and drug targets〔J〕.Neurochem Int，2002;41(5):345-52.

5 Shaftel SS，Kyrkanides S，Olschowka JA，et al.Sustained hippocampal IL-1 beta overexpression mediates chronic neuroinflammation and ameliorates Alzheimer plaque pathology〔J〕.J Clin Invest，2007;117(6):1595-604.

6 Déniz-Naranjo MC，Mu?noz-Fernandez C，Alemany-Rodríguez MJ，et al.Cytokine IL-1 beta but not IL-1 alpha promoter polymorphism is associated with Alzheimer disease in a population from the Canary Islands，Spain〔J〕.Euro JNeurol，2008;15(10):1080-4.

7 Lemere CA.A beneficial role for IL-1 beta in Alzheimer disease〔J〕?J Clin Invest，2007;117(6):1483-5.

8 Akama KT，Van Eldik LJ.β-Amyloid stimulation of inducible nitric-oxide synthase in astrocytes is interleukin-1β-and tumor necrosis factor-α(TNFα)-dependent，and involves a TNFα receptor-associated factor-and NFκB-inducing kinase-dependent signaling mechanism〔J〕.JBiol Chem，2000;275(11):7918-24.

9 Bellucci A，Westwood AJ，Ingram E，et al.Induction of inflammatory mediators and microglial activation in mice transgenic for mutant human P301Stau protein〔J〕.Am J Pathol，2004;165(5):1643-52.

10 Malyak M，Guthridge JM，Hance KR，et al.Characterization of a low molecular weight isoform of IL-1 receptor antagonis〔t J〕.JImmunol，1998;161(4):1997-2003.

11 Dinarello CA.Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism〔J〕.Blood，1991;77(8):1627-52.