劉楠楠 董志恒 李 才

(北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132013)

糖尿病腎病(DN)是導(dǎo)致慢性腎衰竭的主要因素，DN的早期病變特征為腎小球肥大、腎小球基底膜增厚、系膜區(qū)細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積，其發(fā)病機制尚未明了。近年來有研究表明核因子-κB(NF-κB)與 DN 有密切關(guān)系〔1，2〕。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法研究NF-κB在DN腎臟中的表達，探討貝那普利對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病(DM)大鼠的腎臟保護作用，及其與腎臟NF-κB表達之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇Wistar大鼠34只，體重250～300 g，雌雄各半，購自吉林省藥品檢驗所實驗動物科，血糖正常。大鼠自由飲水、進食，實驗期墊料保持干燥，室溫保持在18℃ ～20℃。實驗分為正常對照(N)組(n=10)、DN組(n=12)、DN加貝那普利治療(DNB)組(n=12)。

1.2 方法

1.2.1 造模 按50 mg/kg體重劑量給Wistar大鼠腹腔注射STZ(美國，Sigma公司)，使用前用0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液溶解，pH4.2，誘導(dǎo)DM模型。N組僅注射等量生理鹽水。72 h后經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖及尿糖，血糖≥16.7 mmol/L，且尿糖強陽性，動物多飲、多食、尿量增多被確定為DM大鼠。DM模型建立后，給DNB組大鼠用貝那普利10 mg/kg灌胃，1次/d，連續(xù)12 w，其他兩組動物每日僅給予等量自來水灌胃，實驗期間動物自由進食飲水，未用胰島素治療。

1.2.2 標(biāo)本采集 實驗第12周末，將大鼠放入代謝籠準(zhǔn)確收集24 h尿量，按檢測要求進行樣品預(yù)處理，離心(2 000 r/min，10 min)，去除沉渣，置4℃保存待測。收集尿液期間動物禁食，自由飲水，盡量減少聲、光等對動物的刺激。并于12 w末稱量各組動物體重，然后將所有動物在乙醚麻醉下眶后靜脈采血，肝素抗凝，2 000 r/min離心10 min，分離血清，－74℃冰箱里凍存。取出腎臟，稱量，并經(jīng)腎門冠狀面取組織，10%中性甲醛固定，待作腎臟病理檢查。

1.2.3 生化指標(biāo)測定 采用自動生化分析儀(日立7150型)測定血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、尿肌酐、血清總膽固醇(TC)，并計算內(nèi)生肌酐(Ccr)清除率(ml/min)=尿肌酐/血肌酐×min尿量;采用考馬斯亮藍法測定24 h尿總蛋白排泄量。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢查 將10%中性甲醛固定的腎組織塊制成4μm厚石蠟切片，采用免疫組織化學(xué)(SP法)檢測腎組織NF-κB陽性表達，一抗為免抗鼠 NF-κB p65的多克隆抗體(Stanta Gruz公司)，具體操作步驟按說明書進行，最后加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液顯色。每組切片在高倍視野下(×400)隨機選取20個視野，每個視野中含有一個腎小球，胞核呈棕褐色為NF-κB陽性表達，即陽性細胞，分別計算腎小球陽性細胞數(shù)，以每組的均值進行比較。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)均以x±s表示，所有數(shù)據(jù)行方差分析，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組體重、腎重、血糖及24 h尿蛋白變化 見表1。注射STZ后，DM大鼠體重減輕，血糖升高，24 h尿總蛋白升高，表明DM模型建立成功。

表1 各組體重、腎重、腎重/體重、血糖及尿總蛋白變化(x±s)

2.2 各組BUN、Scr、Ccr、TC的變化 DN組在第12周末血清BUN、Scr、Ccr及TC較N組均有不同程度升高。經(jīng)灌服貝那普利治療后，DNB組 BUN、Scr、Ccr、TC較 DN組明顯減少(P＜0.01)。見表2。

表2 各組BUN、Scr、Ccr、TC變化(x±s)

2.3 各種腎組織NF-κB蛋白變化 N組大鼠僅見極少數(shù)的腎小球細胞表達NF-κB，NF-κB陽性細胞數(shù)為(2.1±0.4);DN組大鼠NF-κB在腎小球細胞中呈高水平表達，陽性細胞數(shù)量(18.1±4.2)顯著上升;DNB組腎小球陽性細胞數(shù)(8.3±2.4)低于DNB組，但高于N組。

3 討論

DN是DM導(dǎo)致終末期腎衰竭的重要原因，腎小球基底膜增厚、系膜區(qū)ECM沉積是DM的病變特征。NF-κB是重要的轉(zhuǎn)錄因子，靜息情況下，在細胞質(zhì)中，NF-κB處于失活狀態(tài);當(dāng)細胞受刺激時，NF-κB隨即進入細胞核內(nèi)，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究表明，NF-κB 與 DN 發(fā)病密切相關(guān)〔3〕。NF-κB 是一種與炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生、細胞增生和細胞外基質(zhì)交聯(lián)有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子。許多與腎臟疾病進展有關(guān)的因子如單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、黏附分子等基因啟動子中含有NF-κB結(jié)合位點，提示NF-κB可能在腎臟疾病的發(fā)病中起著重要作用。目前研究認為DM時高血糖通過多種途徑激活機體的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致DN的主要因素。NF-κB是炎癥反應(yīng)鏈的“基因開關(guān)”，參與許多細胞因子的表達調(diào)控，在靜息狀態(tài)下，NF-κB與I B/NF-κB解離，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞核中，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在DM、DN時蛋白的非酶糖化晚期糖化終末產(chǎn)物(AGEs)和其特異性受體結(jié)合可激活NF-κB，激活的NF-κB向細胞核易位，從而啟動其下游基因轉(zhuǎn)錄如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TNF-β、白細胞介素-6(IL-6)、E-選擇素(E-seletin)、細胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管黏附因子-1(VCAM-1)、MCP-1等過度表達〔4〕。其中激活的 TNF-α 可以再激活 NF-κB，而激活的 NF-κB可以放大AGEs的效應(yīng)，這有可能是炎癥過度反應(yīng)的機制之一。研究發(fā)現(xiàn)，DN患者外周單個核細胞NF-κB活性較DM患者明顯增強，并與蛋白尿程度和血漿調(diào)節(jié)蛋白濃度相關(guān)〔5〕。NF-κB通過調(diào)控一系列重要免疫因子基因表達與免疫和炎癥反應(yīng)，同時與參與細胞生長調(diào)控。近年來研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的活化與腎小球系膜細胞增殖和分泌炎癥因子密切相關(guān)〔6〕。有人發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的腎小球系膜細胞中NF-κB活性能促進系膜細胞的增殖，且對系膜細胞分泌的多種化學(xué)因子起著調(diào)控作用〔7〕。提示NF-κB轉(zhuǎn)錄活性異常在DN的發(fā)生發(fā)展中可能起著重要作用。在本實驗中也發(fā)現(xiàn)，正常對照組僅見極少部分腎小球系膜細胞有較弱的NF-κB的陽性表達，意味著適量的NF-κB活化有調(diào)節(jié)正常腎臟細胞生理功能的作用。DN組大鼠腎小球細胞有較強的NF-κB表達，表明DM狀態(tài)時腎組織的NF-κB被異常激活，這種異常的激活可能是DN發(fā)生的一個重要環(huán)節(jié)。

實驗證實DM大鼠腎組織NF-κB被激活后，使腎臟伴有炎細胞浸潤及腎小球系膜區(qū)基質(zhì)大量沉積。早期炎癥干預(yù)，對預(yù)防DM和DN的炎癥反應(yīng)，延緩病情進展有益。由于DM大鼠維持在高血糖狀態(tài)，貝那普利可通過降低血糖，抑制前炎癥介質(zhì)NF-κB及其下游炎癥介質(zhì)的釋放而減輕腎臟的損傷;同時，貝那普利既能直接抑制血管緊張素的活性，降低血中血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的濃度，阻止其升高血壓的作用;又能抑制腎組織中NF-κB的活化，減輕腎臟的炎癥反應(yīng)，阻止腎小球系膜細胞增生肥大，促進ECM的降解，抑制膠原蛋白的合成，延緩腎小球的硬化。

研究結(jié)果表明，經(jīng)貝那普利治療后的DNB組大鼠24 h尿總蛋白、BUN、Scr較非治療的DN組降低，腎小球內(nèi)ECM沉積減少，提示貝那普利可通過降低血糖、血脂，減少DM大鼠尿蛋白排泄，抑制腎小球肥大及腎間質(zhì)纖維化，抑制腎組織NF-κB異常激活，減少致炎因子、細胞因子，降低基質(zhì)蛋白的生成和沉積，最終減輕腎臟的病理形態(tài)學(xué)損傷，從而發(fā)揮對腎臟的保護作用，為防治DM及DN具有重要的臨床意義。

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