沈亦紅

(浙江省醫(yī)療器械研究所，浙江 杭州 310009)

近年來(lái)，白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)開(kāi)展極為普遍，然而在成熟期白內(nèi)障和缺乏良好紅光反射的白內(nèi)障超聲乳化手術(shù)過(guò)程中，完成連續(xù)環(huán)形撕囊極為困難，處理不當(dāng)易造成撕囊口放射狀撕裂及一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，影響超聲乳化手術(shù)操作。為此，眼科臨床不斷地探索著各種方法，實(shí)踐證明，前囊膜染色劑的應(yīng)用可以很大程度上降低此類(lèi)手術(shù)的難度，減少術(shù)中并發(fā)癥的出現(xiàn)，提高手術(shù)成功率。目前藍(lán)域染色在白色白內(nèi)障超聲乳化術(shù)中應(yīng)用研究比較多，但未發(fā)現(xiàn)對(duì)于其本身化學(xué)物質(zhì)溶出物的試驗(yàn)研究。從毒理學(xué)角度考慮，染色劑類(lèi)醫(yī)用材料中的易溶出物質(zhì)，如化學(xué)助劑殘留等是引起炎癥和組織免疫反應(yīng)的主要原因。因此，為了降低對(duì)眼內(nèi)組織的毒性，保護(hù)白內(nèi)障患者在超聲乳化手術(shù)中的安全，對(duì)藍(lán)域染色劑中化學(xué)助劑殘留量的研究和控制非常重要。

目前，歐洲、日本、美國(guó)及中國(guó)均無(wú)染色劑中化學(xué)殘留助劑的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法。由于藍(lán)域染色劑組成復(fù)雜，分析時(shí)往往干擾測(cè)定，樣品前處理既要保證殘留助劑從樣品基體中分離出來(lái)，又要防止其他干擾成分過(guò)度析出造成干擾。本次試驗(yàn)研究目的是預(yù)測(cè)溶出的水平，對(duì)從染色劑中可能溶出的殘留助劑進(jìn)行詳細(xì)的分析，選擇適當(dāng)?shù)臉悠非疤幚矸椒ê蛢x器檢測(cè)條件，使樣品中被檢測(cè)成分的分離效果更佳、靈敏度更高、受干擾的程度更小。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑。Agilent 6890N氣相色譜儀、7694E頂空進(jìn)樣裝置、氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)和色譜工作站 (Agilent公司，美國(guó))，頂空瓶 (體積10mL);丙酮、異丙醇均為色譜純，購(gòu)自美國(guó) TEDIA“天地”試劑公司;氯化鈉(NaC1)為優(yōu)級(jí)純，購(gòu)自德國(guó)默克公司，用前于450℃烘3～4h(去除吸附的有機(jī)物);Milli－Q超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。取10 mL容量瓶?jī)蓚€(gè)，加超純水?dāng)?shù)毫升，準(zhǔn)確稱(chēng)重。各滴加2滴丙酮和異丙醇，再稱(chēng)重。增加的量即為丙酮或異丙醇的量，加超純水至刻度。計(jì)算含量后，取適量以上溶液用超純水配置成2種化學(xué)助劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。此標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為:丙酮 9.05mg/mL，異丙醇10.62 mg/mL。準(zhǔn)確移取一定體積的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，根據(jù)檢測(cè)器的靈敏度及線(xiàn)性要求，用水稀釋成適用濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，待測(cè)。

1.3 儀器條件。

1.3.1 Agilent 7694E/Headspace Sample 爐溫:80℃，進(jìn)樣環(huán)溫度:90℃，傳輸管溫度:100℃;GC循環(huán)時(shí)間:5 min，樣本預(yù)熱時(shí)間:30 min，加壓時(shí)間:0.2 min，進(jìn)樣時(shí)間:1 min。

1.3.2 Agilent 6890N/ALS Chemstation 進(jìn)樣口:溫度200℃，分流比6:1;色譜柱:毛細(xì)管柱DB－WAX 30m* 0.32mm 膜 厚 0.5μm，流 速1.5mL/min;爐箱:溫度90℃，程序時(shí)間3min;檢測(cè)器:溫度200℃，H2流速30.0 mL/min，壓縮空氣流速350mL/min，氮?dú)庋a(bǔ)氣流速20mL/min。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制。取1.0 mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，置10mL頂空瓶中，準(zhǔn)確加入超純水1.0mL，同時(shí)加入0.76gNaCl，立即蓋上瓶蓋輕輕搖勻，在設(shè)定的頂空及色譜條件下進(jìn)行分析。根據(jù)保留時(shí)間定性，以峰面積對(duì)濃度分別繪制丙酮和異丙醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5 樣品處理。稱(chēng)量樣品1.0g(精確至1mg)，置10mL頂空瓶中，準(zhǔn)確加入超純水1.0mL，同時(shí)加入0.76gNaCl，立即蓋上瓶蓋輕輕搖勻，在設(shè)定的頂空及色譜條件下進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析。參考分析目標(biāo)物 (荷蘭 Dutch Ophthalmic Research Center International B.V.公司生產(chǎn)的 Vision Blue0.5mL瓶裝染色劑，成分為0.1%臺(tái)盼藍(lán)磷酸鹽緩沖溶液)的性質(zhì)和安捷倫氣相色譜柱應(yīng)用說(shuō)明。初選實(shí)驗(yàn)條件:頂空平衡溫度100℃、平衡時(shí)間60min、進(jìn)樣溫度105℃，傳輸線(xiàn)溫度120℃、進(jìn)樣時(shí)間0.05min，毛細(xì)管柱DBWAX 30m*0.32mm膜厚0.5μm，初溫50℃保持2 min、10℃/min升溫至230℃保持5 min程序升溫，柱流速1.5mL/min，氣化室溫度200℃、分流比6:1，檢測(cè)器250℃。

樣品在5min前完全出峰，參考相關(guān)有機(jī)溶劑的氣相色譜圖，用標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)溶劑定性出樣品中殘留的是丙酮和異丙醇兩種化學(xué)助劑。

2.2 定量分析。

2.2.1 頂空條件的選擇。

平衡溫度。依據(jù)測(cè)定物的沸點(diǎn)來(lái)選擇頂空平衡溫度。將20μg/mL丙酮、異丙醇對(duì)照液分別在60℃、70℃、80℃、100℃ 溫度下平衡30 min后進(jìn)行測(cè)定，得到峰面積與平衡溫度間的關(guān)系 (見(jiàn)圖1)。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在相同的平衡時(shí)間條件下，隨著樣品平衡溫度的升高，進(jìn)入氣相的丙酮和異丙醇的量增加，從而提高分析的靈敏度。但平衡溫度過(guò)高時(shí)頂空瓶的氣密性變差，影響方法的精密度，所以實(shí)際工作中一般在滿(mǎn)足靈敏度的前提下盡量選擇較低的平衡溫度。本研究中，設(shè)定平衡溫度為80℃。

圖1 平衡溫度對(duì)萃取效率的影響

平衡時(shí)間。平衡時(shí)間取決于被測(cè)組分分子從樣品基質(zhì)到氣相的擴(kuò)散速度，即與分子大小、介質(zhì)黏度及溫度有關(guān)。設(shè)定平衡溫度為80℃，分別測(cè)定平衡時(shí)間為20min，30min，40min，50min，60min時(shí)上述對(duì)照液的峰面積，結(jié)果顯示，平衡時(shí)間少于30 min時(shí)，隨著時(shí)間的增加，峰面積明顯增加;當(dāng)平衡時(shí)間超過(guò)30 min時(shí)，峰面積增幅趨緩，頂空的氣－液兩相已基本達(dá)到平衡。故本研究中頂空平衡時(shí)間選擇30 min。

基質(zhì)效應(yīng)的消除和減少的方法、頂空氣體中各組分的含量除與其本身的揮發(fā)性有關(guān)，還與樣品的基質(zhì)有關(guān)，如丙酮和異丙醇易溶于水，與水存在較強(qiáng)的相互作用，因而富集效率低，較高的平衡溫度還會(huì)造成大量的水蒸氣。選擇加入0.76g氯化鈉具有提高溶液的離子強(qiáng)度、降低有機(jī)化合物在水中溶解度的作用，可以有效地消除樣品的基質(zhì)效應(yīng)，從而準(zhǔn)確進(jìn)行定量分析。

2.2.2 色譜條件的選擇。根據(jù)丙酮和異丙醇的結(jié)構(gòu)性質(zhì)及相關(guān)資料，通過(guò)實(shí)驗(yàn)，我們選擇毛細(xì)管柱DB－WAX 30m*0.32mm膜厚0.5μm。在進(jìn)樣口溫度200℃、FID檢測(cè)器溫度200℃的條件下選擇爐箱恒溫90℃，柱流速1.5mL/min，分流比6:1。丙酮2.3 min出峰，異丙醇2.5min出峰，各峰的分離度和理論塔板數(shù)見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照品氣相色譜分析數(shù)據(jù)

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證。

2.3.1 校準(zhǔn)曲線(xiàn)、線(xiàn)性范圍及檢出限。在分析確認(rèn)的色譜條件下測(cè)定丙酮和異丙醇混合標(biāo)準(zhǔn)系列的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。以信噪比S/N=3對(duì)應(yīng)檢出限，將5倍的檢出限作為方法定量下限見(jiàn)表2。

表2 各成分校準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程、線(xiàn)性范圍、檢出限及定量限

2.3.2 精密度及準(zhǔn)確度。配制10μg/mL的丙酮和異丙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液試樣進(jìn)行6次測(cè)定。丙酮含量平均值為 9.314μg/mL，精密度 (RSD)為 3.507%，回收率 96.5%;異丙醇含量平均值為10.376μg/mL，精密度 (RSD)為2.926%，回收率98.8%，結(jié)果表明精密度準(zhǔn)確度良好。

2.3.3 加標(biāo)回收率試驗(yàn)。取同一樣品3份，分別加入3種不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定丙酮和異丙醇濃度。結(jié)果顯示80%、100%、120%的樣品回收率，分別為丙酮為90～95%，異丙醇為89～95%，(n=6)。表明回收率情況良好。

2.4 樣品測(cè)定。分別對(duì)2個(gè)不同批號(hào)藍(lán)域染色劑中的丙酮、異丙醇?xì)埩袅堪凑胀鈽?biāo)法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 眼科手術(shù)藍(lán)域染色劑化學(xué)助劑殘留量測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)曾采用對(duì)樣品先進(jìn)行蒸餾，收集餾出液直接進(jìn)樣法。該樣品預(yù)處理回收率低，且長(zhǎng)期直接進(jìn)樣，樣品餾出液溶劑水會(huì)降低毛細(xì)管柱柱效。因此本實(shí)驗(yàn)采用頂空進(jìn)樣法，以水為溶劑，不僅可以延長(zhǎng)柱子的壽命，而且空白對(duì)照液沒(méi)有雜質(zhì)峰。同時(shí)，該方法樣品前處理操作簡(jiǎn)便、方法的線(xiàn)性范圍寬、精密度好、準(zhǔn)確度高、快速靈敏，適宜長(zhǎng)期對(duì)染色劑進(jìn)行質(zhì)量控制。

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