賀又舜 艾碧琛 趙國榮 肖碧躍 曾序求 何宜榮 張 衎

湖南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（湖南長沙410208）

隨著對內(nèi)毒素血癥、全身炎癥反應(yīng)綜合征認(rèn)識的深入，以及近年中醫(yī)衛(wèi)氣營血辨證對非典型性肺炎、H1N1流感等疾病的確切防治效果，人們越來越意識到衛(wèi)氣營血辨證診療感染性疾病的有效性［1］。筆者前期研究結(jié)果提示實驗兔在大腸桿菌內(nèi)毒素（LPS）攻毒后，癥狀和體征出現(xiàn)了較為有規(guī)律的3個階段，即攻毒后0～2h、2～6h、6～36h，3個階段分別與衛(wèi)分證、氣分證、營血分證相關(guān)［2］。本次實驗旨在觀察內(nèi)毒素血癥兔不同時相白細(xì)胞（WBC）總數(shù)及分類、血小板計數(shù)（BPC）及凝血功能的變化以及3個不同階段與中醫(yī)衛(wèi)氣營血辨證的相關(guān)性，以期為衛(wèi)氣營血辨證防治內(nèi)毒素血癥的研究提供動物實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物普通級新西蘭大耳白兔，雌雄不限，體質(zhì)量1.8～2.0kg，由長沙市東創(chuàng)實驗動物科技服務(wù)部提供，動物許可證號：SCXK（湘）2009-0012。 室溫控制在 24～27℃，單籠飼養(yǎng)，自由飲食和攝水。

1.2 試劑LPS Escherichia coli O111：B4購自美國Sigma-Aldrich公司（生產(chǎn)批號118K4052）。

1.3 試劑配備大腸桿菌LPS在無菌條件下以生理鹽水配制成10μg/mL溶液，使用前以溫水溫浴至39℃。

1.4 分組及造模新西蘭大耳白兔40只，隨機(jī)分成空白組8只，1階段組8只，2階段組12只，3階段組12只。1階段組、2階段組、3階段組由耳緣靜脈注入大腸桿菌LPS 10μg/kg，空白組注入等量無菌生理鹽水。

1.5 觀察項目及方法1階段組觀察時相為攻毒后0～2h，2階段組觀察時相為2.1～6h，3階段組觀察時相為6.1～36h。1階段組在攻毒后1～1.5h內(nèi)心臟采血5mL；2階段組在攻毒后4～5h內(nèi)心臟采血5mL；3階段組實驗兔中，出現(xiàn)精神萎靡，活動度和靈敏度明顯下降、結(jié)膜充血明顯、便血、鼻衄、全身癱軟無力、角弓反張、抽搐等癥狀、體征者［2］則心臟采血5mL，未出現(xiàn)以上癥狀者不予采集標(biāo)本。采集的血液標(biāo)本分成1、4mL兩份，分別進(jìn)行EDTA-2K、枸櫞酸鈉抗凝處理，檢測血液常規(guī)、凝血功能。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，采用方差分析，組間兩兩比較用q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 內(nèi)毒素血癥兔各階段血液常規(guī)變化1階段組、2階段組WBC計數(shù)較空白組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P<0.01），3階段組則比1階段組、2階段組升高（P<0.05或0.01）；1階段組嗜中性粒細(xì)胞比空白組降低 （P<0.05）；2階段組嗜中性粒細(xì)胞百分比較空白組升高，2、3階段組均比1階段組升高；3個階段的淋巴細(xì)胞均比空白組明顯降低（P<0.01），但3個階段之間的差異不明顯；1階段組淋巴細(xì)胞百分比較空白組升高（P<0.05），2、3階段組則比1階段組要顯著降低 （P<0.01）；1、2階段組的單核細(xì)胞較空白組顯著降低 （P<0.01），3階段組則比1、2階段組顯著升高（P<0.01）。 結(jié)果見表1。

2.2 內(nèi)毒素血癥兔各階段凝血功能變化1階段組BPC與空白組比較，差異不明顯，但2、3階段組BPC比空白組明顯降低（P<0.01）， 而且 3階段組比 1、2階段組更為低（P<0.05或0.01）。3階段組凝血酶原時間（PT）、PT-INR均與空白組有顯著性差異 （P<0.05或0.01）；3個階段的部分活化凝血酶原時間（APTT）均比空白組明顯延長（P<0.05），纖維蛋白原（FIB）均較空白組降低（P<0.05或0.01）。3個階段之間的凝血酶時間（TT）

表1 各組血液常規(guī)比較 （±s）

表1 各組血液常規(guī)比較 （±s）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與1階段組比較▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與 2階段組比較，●P＜0.05，●●P＜0.01。 下同。

組 別 n WBC計數(shù)（×109/L）嗜中性粒細(xì)胞（×109/L） 嗜中粒百分比 淋巴細(xì)胞（×109/L） 淋巴細(xì)胞百分比 單核細(xì)胞（×109/L） 單核細(xì)胞百分比空白組 8 5.09±1.66 1.93±1.24 38.09±17.30 2.04±1.71 36.58±24.86 0.45±0.20 10.53±7.20 1 階段組 8 1.12±1.14** 0.31±0.52*26.34±18.28 0.72±0.85** 59.31±22.17* 0.09±0.08** 10.70±6.82 2 階段組 12 1.72±1.95** 1.11±1.15 63.73±21.60*▲▲ 0.18±0.15** 24.79±18.55▲▲ 0.05±0.04** 7.22±2.91 3 階段組 8 4.73±4.40▲▲● 2.59±3.66 49.88±30.64▲ 0.77±0.39** 22.28±19.12▲▲ 0.37±0.21▲▲●● 8.05±6.19

表2 各組凝血功能比較 （±s）

表2 各組凝血功能比較 （±s）

差異不明顯。結(jié)果見表2。

TT（s）空白組 8 391.65±229.13 9.13±0.19 0.66±0.02 22.11±3.85 4.71±1.01 12.95±1.21 1 階段組 8 295.15±145.99 9.74±0.51 0.72±0.05 73.98±53.83*2.38±1.52**17.86±12.00 2 階段組 12 212.04±93.61** 9.97±0.82**0.74±0.08**74.08±45.01*2.77±1.85**13.66±1.72 3 階段組 8 101.94±38.19**▲▲● 9.70±0.70* 0.73±0.07* 77.06±52.53*2.47±0.98* 13.24±2.57組 別 n BPC（×109/L）（s） PT-INR APPT（s）PT FIB（g/L）

3 討 論

炎癥是機(jī)體對各種致炎因子引起損傷所發(fā)生的反應(yīng)，是一種極為常見和重要的基本病理過程。機(jī)體發(fā)生炎癥或其他疾病都可引起WBC總數(shù)及各種WBC百分比發(fā)生變化，因此檢查WBC總數(shù)及WBC分類計數(shù)成為輔助診斷炎癥反應(yīng)的一種重要方法。本研究結(jié)果顯示LPS攻毒后，內(nèi)毒素血癥兔的WBC總數(shù)隨時間呈現(xiàn)動態(tài)變化。在LPS作用下WBC沿著血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生附壁滾動，并游出血管聚集到感染和損傷的部位，以發(fā)揮重要的防御作用，從而使得在攻毒后第1階段血液中WBC總數(shù)出現(xiàn)減少。1～2h后，隨著LPS與其受體結(jié)合后啟動炎癥細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，大量激活的炎細(xì)胞能產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)，后者可使炎細(xì)胞進(jìn)一步被激活，并促進(jìn)骨髓中的WBC釋放入血，這正是第2階段WBC總數(shù)開始上升，第3階段回升至較高水平的主要原因。同時，研究結(jié)果還提示此時釋放入血的WBC更多的是中性粒細(xì)胞。從第2、3階段WBC水平逐漸回升的趨勢可以看出，在第2階段，炎細(xì)胞與促炎介質(zhì)相互激活，出現(xiàn)了炎癥級聯(lián)反應(yīng)；第3階段WBC迅速回升則提示此期促炎介質(zhì)大量釋放、并促進(jìn)WBC釋放入血，炎癥反應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大。

衛(wèi)氣營血辨證是對溫病的病理變化及證候類型進(jìn)行的高度概括，一直以來有效指導(dǎo)著中醫(yī)外感熱病臨床診療。葉天士以衛(wèi)氣營血的生理功能為基礎(chǔ)，將衛(wèi)氣營血的表里層次用來概括病變的深淺及病情的輕重程度，“衛(wèi)之后方言氣，營之后方言血”，溫病由衛(wèi)而氣而營而血，是病邪由淺入深，病情由輕轉(zhuǎn)重的變化過程。筆者以往研究已證實用LPS攻毒后，1階段、2階段、3階段的癥狀體征呈現(xiàn)出由輕轉(zhuǎn)重的趨勢［2］，本研究中1階段→2階段→3階段WBC的整體動態(tài)變化顯示了炎癥反應(yīng)也呈現(xiàn)出發(fā)生、發(fā)展、升級擴(kuò)大的由輕到重的趨勢，與葉天士所言“衛(wèi)之后方言氣，營之后方言血”反映的病情變化規(guī)律相符合。

病原微生物侵入機(jī)體后，一方面激活炎細(xì)胞及炎癥介質(zhì)，另一方面也會激活凝血與纖溶系統(tǒng)。本研究顯示攻毒后第1階段開始，PT以及PT-INR、APTT即出現(xiàn)上升趨勢，同時FIB亦從第1階段即開始下降，呈現(xiàn)出彌漫性血管內(nèi)凝血（DIC）的實驗室改變特征，反應(yīng)此期已出現(xiàn)凝血、抗凝及纖維蛋白溶解系統(tǒng)的紊亂，并且一開始即表現(xiàn)出低凝、纖溶，這提示靜脈注射LPS后引起DIC急性進(jìn)展。在第1階段即出現(xiàn)低凝、纖溶等，與不少學(xué)者認(rèn)為凝血功能異常是溫病過程中一個重要的病理變化是一致的［3］。但此期的BPC減少并不顯著，故低凝狀態(tài)尚不嚴(yán)重，出血傾向并不會明顯，故一般并不會出現(xiàn)出血癥狀，符合溫病衛(wèi)分證的病機(jī)。進(jìn)入第2、3階段，PT及APTT仍然處于延長的狀態(tài)，F(xiàn)IB亦保持下降，最突出而重要的變化是BPC呈進(jìn)行性下降，第3階段下降至整個實驗過程的最低值，提示第2、3階段大量BPC持續(xù)被消耗，逐漸引起凝血障礙；同時隨著纖維蛋白大量降解，纖維蛋白降解產(chǎn)物有多方面的抗凝作用，最終導(dǎo)致低凝狀態(tài)的加重，從而可引起出血癥狀。實驗觀察到的第3階段部分實驗兔出現(xiàn)便血、鼻衄［2］正是因此而發(fā)生。上述凝血功能的變化提示本實驗內(nèi)毒素血癥兔第3階段的病理與溫病營分證營熱陰傷、擾神竄絡(luò)的病機(jī)及血分證迫血妄行、瘀熱內(nèi)阻的病機(jī)密切相關(guān)。從1階段→2階段→3階段凝血功能變化整體來看，體現(xiàn)的也正是由衛(wèi)而氣再至營血分，病情由輕到重的整體變化規(guī)律。

［1］趙國榮，肖碧躍，盧岳華，等.衛(wèi)分證與氣分證、營分證IL-6、IL-10變化規(guī)律對比研究［J］.新中醫(yī)，2005，37（6）：19-21.

［2］艾碧琛，趙國榮，賀又舜，等.衛(wèi)氣營血階段性與內(nèi)毒素血癥兔不同時相癥狀、體征的相關(guān)性研究［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，31（3）：10-13.

［3］林培政，葛文華.溫病實驗研究概況［J］.新中醫(yī)，2003，35（5）：74-76.