蔣永康 何晶 李潔 曹誼林 劉偉

組織工程化肌腱為修復(fù)肌腱缺損提供了良好的前景[1]。由于肌腱缺乏特異的分子標(biāo)志，肌腱發(fā)育生物學(xué)的研究進(jìn)展緩慢，極大地限制了組織工程化肌腱研究的進(jìn)展。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Tenomodulin（TNMD）是肌腱相對(duì)特異的分子標(biāo)志，在肌腱發(fā)育成熟中起著重要作用[2－3]。研究表明，TNMD基因敲除小鼠的肌腱細(xì)胞增殖明顯減弱，細(xì)胞密度降低；膠原纖維直徑相互之間差異增大，出現(xiàn)直徑明顯粗大的纖維[4]。因此，推測(cè)TNMD可能影響肌腱相關(guān)基因的表達(dá)，而目前未見此方面研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)在NIH3T3和C3H10T1/2細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)TNMD，定量PCR檢測(cè)肌腱相關(guān)基因的表達(dá)情況，從而對(duì)TNMD在肌腱發(fā)育成熟中的作用有所了解，為組織工程肌腱的構(gòu)建提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)液（Gibco公司，美國(guó)），胎牛血清（Hyclone公司，美國(guó)），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)），質(zhì)粒小抽提試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)），F(xiàn)ugene HD Transfection Reagent（Roche 公司，瑞士），PCR試劑盒（Takara公司，日本），定量PCR試劑盒（SYBR Green，Applied Biosystems公司，美國(guó)），倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本），定量PCR熒光探測(cè)儀（Stratagene 公司，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

分別將液氮中凍存的NIH3T3細(xì)胞系 （本實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞庫(kù)）和C3H10T1/2細(xì)胞系（中科院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究所丁小燕實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)）快速?gòu)?fù)蘇，用含10%胎牛血清和100 μg/mL青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液重懸，以1×105個(gè)細(xì)胞/皿接種于10 cm培養(yǎng)皿中，第二天換液去除死細(xì)胞。以后每隔2 d換液，待細(xì)胞增殖達(dá)到80%～90%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.3 pCAGGS空載體和pCAGGS-TNMD表達(dá)載體準(zhǔn)備

pCAGGS-TNMD表達(dá)載體由日本京都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所Hiraki實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，過(guò)夜搖菌，質(zhì)粒小抽提，酶切鑒定從而得到足夠數(shù)量的pCAGGS-TNMD表達(dá)載體。因TNMD剛好是插在pCAGGS的兩個(gè)EcoR1中間，因此pCAGGS-TNMD表達(dá)載體經(jīng)EcoRⅠ酶切后瓊脂糖凝膠電泳，切取線性化的pCAGGS質(zhì)粒，T4連接酶16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化DH5α，搖菌，小抽提，酶切和電泳鑒定從而得到足夠數(shù)量的pCAGGS空載體。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

前一天先將上述兩種細(xì)胞系分別接種于六板孔中，確保第二天達(dá)到70%～80%的匯合度。照Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書流程，分別配好含pCAGGS空載體和pCAGGS-TNMD表達(dá)載體的Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑，靜置15 min后，加入細(xì)胞中，置入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，換含有800 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，每3天換液，約12 d左右，細(xì)胞絕大部分已死亡，而已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞呈克隆生長(zhǎng)。將存活的細(xì)胞用有限稀釋法接種于96孔板中，分別篩選出單克隆來(lái)源的pCAGGS空載體和pCAGGSTNMD表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的NIH3T3和C3H10T1/2細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的形態(tài)。此兩種細(xì)胞用含有400 μg/mL G418的DMEM培養(yǎng)液維持培養(yǎng)并用于后續(xù)研究。

1.5 RT-PCR和定量PCR

小鼠第一代肌腱細(xì)胞（mTP1），轉(zhuǎn)染了pCAGGS空載體 (pCAGGS)和pCAGGS-TNMD表達(dá)載體（pCAGGS-TNMD）的 NIH3T3和 C3H10T1/2細(xì)胞用Trizol處理后，常規(guī)提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別設(shè) 計(jì) 針 對(duì) actin、pCAGGS、TNMD、collagen Ⅰ （COLⅠ）、collagenⅥ （COLⅥ）和biglycan的引物。 利用PCR試劑盒對(duì)actin、pCAGGS、TNMD進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，證實(shí)TNMD已成功轉(zhuǎn)染后，再利用SYBR Green熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)TNMD和其它基因表達(dá)情況。Actin作為內(nèi)參，每個(gè)樣本重復(fù)3次，且每個(gè)基因每次3個(gè)復(fù)孔，以確保數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和準(zhǔn)確度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

定量PCR數(shù)據(jù)經(jīng)內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化后，將pCAGGS空載體組設(shè)為1，pCAGGS-TNMD表達(dá)載體組的值為與空載體組的相對(duì)值，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNMD轉(zhuǎn)染檢測(cè)

對(duì)于NIH3T3細(xì)胞系：RT-PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染了pCAGGS空載體的細(xì)胞不表達(dá)TNMD；而轉(zhuǎn)染了pCAGGS-TNMD表達(dá)載體的細(xì)胞表達(dá)TNMD，其強(qiáng)度要略高于 mTP1（圖 1A）。定量 PCR顯示，pCAGGS-TNMD表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組要比對(duì)照pCAGGS空載體轉(zhuǎn)染組高約25 000倍（P<0.05）（圖1B）。以上結(jié)果表明，TNMD在NIH3T3細(xì)胞中已成功轉(zhuǎn)染。

對(duì)于C3H10T1/2細(xì)胞系：RT-PCR檢測(cè)顯示，轉(zhuǎn)染了pCAGGS空載體的細(xì)胞只微弱地表達(dá)TNMD；而轉(zhuǎn)染了pCAGGS-TNMD表達(dá)載體的細(xì)胞高表達(dá)TNMD，其強(qiáng)度明顯高于mTP1（圖1C）。同時(shí)定量PCR顯示，pCAGGS-TNMD表達(dá)載體轉(zhuǎn)染組要比對(duì)照pCAGGS空載體轉(zhuǎn)染組高約350倍 （P<0.05）（圖1D）。以上結(jié)果表明，TNMD在C3H10T1/2細(xì)胞中也已成功轉(zhuǎn)染。

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

倒置相差顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，無(wú)論是NIH3T3細(xì)胞還是C3H10T1/2細(xì)胞，轉(zhuǎn)pCAGGS空載體和TNMD過(guò)表達(dá)的細(xì)胞與原正常細(xì)胞在形態(tài)上沒有明顯改變，均呈小鼠肌腱細(xì)胞樣的長(zhǎng)梭形排列，細(xì)胞生長(zhǎng)正常（圖2）。

2.3 肌腱相關(guān)基因的表達(dá)檢測(cè)

對(duì)于NIH3T3細(xì)胞系：定量PCR顯示，過(guò)表達(dá)TNMD后，COLⅠ沒有明顯改變，但COLⅥ和biglycan 均顯著降低（P<0.05）（圖 3）。

對(duì)于C3H10T1/2細(xì)胞系：定量PCR顯示，過(guò)表達(dá) TNMD后，COLⅠ和biglycan明顯升高（P<0.05），但COLⅥ沒有明顯改變（圖4）。

圖1 RT-PCR和定量PCR檢測(cè)TNMD在基因轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞系（A，B）和C3H10T1/2細(xì)胞系（C，D）中的表達(dá)（mTP1:小鼠第一代肌腱細(xì)胞；pCAGGS：pCAGGS 空載體；pCAGGS-TNMD：pCAGGS-TNMD 表達(dá)載體；*：P<0.05）Fig.1 Expression of TNMD in NIH3T3(A,B)and C3H10T1/2 cells(C,D)after transfection by RT-PCR and Quantitative PCR(mTP1:mouse tenocytes of passage 1;pCAGGS:pCAGGS empty vector;pCAGGS-TNMD:pCAGGS-TNMD expression vector;*:P<0.05)

圖2 轉(zhuǎn)染TNMD前后NIH3T3細(xì)胞系（A-C）和C3H10T1/2細(xì)胞系（D-F）的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(倒置相差顯微鏡，40×)Fig.2 Morphology observation of NIH3T3(A-C)and C3H10T1/2 cells(D-F)after transfection(Inverted phase contrast microscope,40×)

圖3 定量PCR檢測(cè)TNMD轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞系對(duì)肌腱相關(guān)基因表達(dá)的作用Fig.3 The expression of tenocyte related genes in NIH3T3 cells after transfection by Quantitative PCR

圖4 定量PCR檢測(cè)TNMD轉(zhuǎn)染C3H10T1/2細(xì)胞系對(duì)肌腱相關(guān)基因表達(dá)的作用Fig.4 The expression of tenocyte related genes in C3H10T1/2 cells after transfection by Quantitative PCR

3 討論

TNMD是一個(gè)由317個(gè)氨基酸組成的Ⅱ型跨膜蛋白，主要表達(dá)于致密結(jié)締組織，如肌腱和韌帶中，具有抑制血管生成的作用[5－6]。其結(jié)構(gòu)與另一種具有抗血管生成的蛋白Chondromodulin-Ⅰ（ChM-Ⅰ）高度同源，而后者主要在軟骨中表達(dá)。在雞胚發(fā)育過(guò)程中，TNMD的表達(dá)與肌腱始基的形成具有高度相關(guān)性，其表達(dá)部位與scleraxis基本一致，而scleraxis是TNMD的上游，能調(diào)控后者的表達(dá)[7]。TNMD基因敲除小鼠的肌腱細(xì)胞增殖明顯減弱，細(xì)胞密度降低；膠原纖維直徑差異增大，出現(xiàn)明顯粗大的纖維[4]。然而，TNMD對(duì)肌腱形成的直接作用以及作用機(jī)理目前尚不明確。我們推測(cè)TNMD很可能是影響了肌腱相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮作用，因此設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

NIH3T3細(xì)胞系是小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系，自身基本不表達(dá)TNMD；C3H10T1/2細(xì)胞系是小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞系，自身表達(dá)低水平的TNMD。這兩種細(xì)胞系都與肌腱細(xì)胞一樣來(lái)自中胚層，有大量研究顯示，成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞都能作為組織工程肌腱的種子細(xì)胞[8－9]，因此選用上述兩種細(xì)胞系用于過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型。過(guò)表達(dá)TNMD前后，NIH3T3細(xì)胞系和C3H10T1/2細(xì)胞系在形態(tài)上都沒有明顯差別。但是，在肌腱相關(guān)基因水平上，兩種細(xì)胞系的結(jié)果具有顯著差異。在NIH3T3細(xì)胞系中，COLⅥ和biglycan顯著降低，這與實(shí)驗(yàn)預(yù)期相反。在C3H10T1/2細(xì)胞系中，COLⅠ和biglycan明顯升高。上述差別所產(chǎn)生的原因可能是：NIH3T3細(xì)胞中未檢測(cè)到有TNMD的表達(dá)，表明其生長(zhǎng)未受到TNMD的調(diào)控，轉(zhuǎn)入TNMD后可能引起了其肌腱相關(guān)蛋白合成的紊亂。而C3H10T1/2本身表達(dá)一定的TNMD，適應(yīng)了TNMD的調(diào)控，過(guò)表達(dá)TNMD后能有效地增強(qiáng)相關(guān)基因的表達(dá)。相關(guān)原因有待進(jìn)一步研究。

COLⅠ是肌腱中表達(dá)的主要膠原分子，在肌腱的形態(tài)維持和力學(xué)性能中起主要作用。COLⅥ是肌腱中表達(dá)的小分子膠原，能與COLⅠ和decorin等細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，維持整個(gè)肌腱纖維結(jié)構(gòu)的完整性[10]。COLⅥ基因突變會(huì)導(dǎo)致Bethlem肌病和Ullrich先天性肌萎縮病[11]。Biglycan是肌腱中表達(dá)的一類富亮氨酸的小分子蛋白多糖，能與COLⅠ相結(jié)合，對(duì)維持肌腱的膠原纖維結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)和穩(wěn)定起重要作用。Biglycan基因敲除小鼠膠原纖維直徑變小，形態(tài)異常，肌腱力學(xué)性能降低[12]。在C3H10T1/2細(xì)胞系中，TNMD過(guò)表達(dá)能明顯上調(diào)COLⅠ和biglycan，說(shuō)明TNMD確實(shí)通過(guò)調(diào)控肌腱相關(guān)基因的表達(dá)而發(fā)揮對(duì)肌腱的作用。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)TNMD對(duì)NIH3T3和C3H10T1/2細(xì)胞系的形態(tài)沒有影響，但能影響肌腱相關(guān)基因的表達(dá)情況。而這種影響在肌腱的膠原合成和超微結(jié)構(gòu)中的作用，以及TNMD與相關(guān)肌腱基因的相互作用機(jī)制都有待于進(jìn)一步研究。

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