張 巖 王玉成 吳英杰 王 超

(林木遺傳育種與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(東北林業(yè)大學(xué))，哈爾濱，150040)

木聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶(xyloglucan endotransglycosylase，XET)是所有植物細(xì)胞壁重建過程中的一個(gè)關(guān)鍵酶，它利用轉(zhuǎn)糖基機(jī)制在植物細(xì)胞壁中進(jìn)行木聚糖多聚體的切割和組裝［1］。在研究豌豆莖的伸長時(shí)發(fā)現(xiàn)，木聚糖鏈的酶切斷裂，可使細(xì)胞壁膨脹疏松，促進(jìn)細(xì)胞生長［2］。Nishitani首次純化了XET蛋白［3－4］，XET一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便在細(xì)胞分化、擴(kuò)展和特化等多方面受到重視，有人甚至認(rèn)為它可能是植物生長機(jī)制中的核心酶。目前已經(jīng)從擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、蕃茄(Solanum lycopersicum)、小麥(Triticum aestivum)、大麥(Hordeum vulgare)、玉米(Zea mays)等作物中分離出10多個(gè)XET基因成員，分別有不同的功能。陳昆松等［5］在用外源乙烯處理誘導(dǎo)獼猴桃軟化的過程中發(fā)現(xiàn)XET活性快速增加，促進(jìn)了細(xì)胞壁的膨脹疏松。Lu等［6］在香蕉果實(shí)軟化過程中發(fā)現(xiàn)MA－XETI與香蕉果肉軟化相關(guān)，并且與果皮的硬度密切相關(guān)。近些年，XET活性與木質(zhì)部生長關(guān)系的研究逐漸受到重視。Israelsson等［7］對(duì)過量產(chǎn)生GA的轉(zhuǎn)基因植株檢測分析表明，增加木材形成速率的酶中就包括XET。桉樹中實(shí)時(shí)RT－PCR分析表明，XET在次生木質(zhì)部的表達(dá)水平是在葉子中表達(dá)的360倍，這說明了在次生木質(zhì)部細(xì)胞壁的形成中XET蛋白起著重要作用［8］。與韌皮部相比，XET在擬南芥木質(zhì)部有大量的表達(dá)，表明在木質(zhì)部組織中，XETs可能參與了木葡聚糖鏈的移位使木質(zhì)部細(xì)胞膨脹［9］。

白樺(Betula platyphyllaSuk.)為樺木科樺木屬植物，是目前較為廣泛應(yīng)用的紙漿材樹種之一。研究其次生細(xì)胞壁形成過程中的相關(guān)基因，對(duì)改良白樺的紙漿材特性具有重要的意義。筆者從白樺形成層相關(guān)組織cDNA文庫中克隆得到了白樺XET基因全長cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析及蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，利用Semi－quantative RT－PCR方法分析了該基因在根莖葉不同器官的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究白樺XET基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)方法

1.1 白樺XET基因的克隆和序列分析

本研究構(gòu)建了白樺形成層相關(guān)組織cDNA文庫，對(duì)文庫克隆進(jìn)行隨機(jī)測序，運(yùn)用NCBI的BLASTX和BLASTN程序?qū)Λ@得的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，獲得XET的全長cDNA序列。

利用NCBI ORF Finder確定XET基因的開放讀碼框;利用NCBI的BlastP尋找保守區(qū)，預(yù)測蛋白所屬家族;用ProtParam(http://au.expasy.org/cgi－bin/protparam)分析蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì);用BlastX尋找相似性序列，并選擇與其相似性較高的另外7種植物的XET蛋白氨基酸序列，用多序列聯(lián)配程序ClustalX(1.83)進(jìn)行多序列比對(duì)，構(gòu)建XET基因進(jìn)化樹。

利用ProtScale軟件、HNN軟件等在線分析α－螺旋、β－轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲以及延伸連等蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);利用網(wǎng)站http://au.expasy.Org/tools/中的 Swiss－Model程序進(jìn)行同源建模，預(yù)測XET蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

1.2 sqRT－PCR鑒定XET基因在不同器官的表達(dá)

培養(yǎng)白樺組培苗［10］。選取生長旺盛的單株，洗去培養(yǎng)基，吸干水分。于根、莖、葉3個(gè)部位取材，液氮處理，置于冰箱中－80℃保存。

CTAB法提取白樺根、莖、葉總RNA，經(jīng)DNaseI(Promega)消化處理，去除DNA污染。取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系和操作參照PrimerScriptTMRT Reagent Kit(TaKaRa)。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍，用作sqRT－PCR的模板。選擇TUB作為內(nèi)參基因。內(nèi)參和XET基因的定量PCR引物如表1所示。

表1 sqRT－PCR引物序列

sqRT－PCR 反應(yīng)體系:10×Buffer 2 μL，dNTP(2.5 μmol/L)0.4 μL，上、下游引物各 1 μL(20 μmol/L)，TaqDNA Polymerase 0.25 μL，cDNA 2 μL，去離子水補(bǔ)至20 μL，設(shè)置3 次重復(fù)。PCR反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸30 s，循環(huán)30次，72℃延伸7 min。反應(yīng)產(chǎn)物利用1%EB－瓊脂糖凝膠電泳檢測。運(yùn)用Quantity One Analysis Software對(duì)電泳結(jié)果相對(duì)定量，通過調(diào)整上樣量使內(nèi)參均一化，按照調(diào)整后內(nèi)參的上樣量分析XET基因的表達(dá)量，進(jìn)而用Quantity One Analysis Software得出定量分析的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 白樺XET基因全長cDNA的獲得及序列分析

通過對(duì)白樺形成層相關(guān)組織cDNA文庫隨機(jī)測序和序列比對(duì)分析，獲得白樺XET基因全長cDNA序列。該cDNA編碼區(qū)序列自74位的ATG起，止于954位的TAG，全長882 bp，見圖 1。3＇UTR 135 bp，5＇UTR 73 bp。開放讀碼框編碼由 293個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，編碼蛋白的分子質(zhì)量為33.1 ku，理論等電點(diǎn)為5.49，為酸性蛋白質(zhì);負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)數(shù)為34，正電荷殘基(Arg+Lys)數(shù)為23個(gè);不穩(wěn)定系數(shù)為29.32，為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。

圖1 白樺XET基因序列及由此推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 白樺XET蛋白家族預(yù)測

利用NCBI的BlastP尋找保守區(qū)，結(jié)果表明白樺XET基因具有一個(gè)保守區(qū)，屬于糖基水解酶16超家族，見圖2。利用Pfam程序找到一個(gè)XET C－terminu超家族的保守區(qū)。

2.3 XET多序列比對(duì)及進(jìn)化樹

對(duì)XET基因進(jìn)行BlastX比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)各物種間該基因的蛋白質(zhì)序列相似度較高，選取8種植物XET蛋白的氨基酸序列，運(yùn)用Clustalx(1.83)進(jìn)行多序列比對(duì)，并創(chuàng)建進(jìn)化樹，如圖3、圖4所示。從圖中可以看出，各物種的XET蛋白質(zhì)序列相對(duì)保守，但是N端序列保守性不高，這與蛋白家族保守區(qū)預(yù)測的結(jié)果相似，該基因的大部分序列位于保守區(qū)內(nèi)。進(jìn)化樹分析得出，白樺XET基因與楊樹(Populus tremula)、蓖麻(Actinidia deliciosa)XET基因的同源性較其他物種高。

圖2 BlastP推導(dǎo)的XET氨基酸序列的保守區(qū)預(yù)測

圖3 8個(gè)物種XET蛋白的多序列比對(duì)分析

圖4 XET基因進(jìn)化樹

2.4 白樺XET蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

運(yùn)用ExPASy Proteomics tools中的SOPMA軟件在線分析XET蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖5所示。組成白樺XET蛋白的293個(gè)氨基酸中，25個(gè)氨基酸可能形成α－螺旋，104個(gè)氨基酸可能形成延伸，147個(gè)氨基酸可能形成無規(guī)卷曲，17個(gè)氨基酸可能形成β－轉(zhuǎn)角。

2.5 白樺XET蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)

通過在ExPDB晶體圖像數(shù)據(jù)庫中(http://www.rcsb.org/pdb/)搜索相似的序列，得到一個(gè)同源性較高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。以此序列的結(jié)構(gòu)信息為原子模型登錄Swiss－Model服務(wù)器上進(jìn)行結(jié)構(gòu)排列，并運(yùn)用結(jié)構(gòu)仿真模擬(ProModⅡ程序)和能量最小化分析(GROMOS96程序)構(gòu)建目標(biāo)序列的結(jié)構(gòu)［11－13］，模建結(jié)果見圖 6。利用 Swiss－viewer3.7 對(duì)模建結(jié)果進(jìn)行檢測，計(jì)算得出Ramachandran圖(圖7)，由圖可見，模擬得到的白樺XET蛋白三維結(jié)構(gòu)的Φ角和Ψ角有95%位于Ramachandran圖中合理區(qū)域，從理論上表明此三維結(jié)構(gòu)是可靠的。

圖5 白樺XET蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

圖6 白樺XET蛋白的空間結(jié)構(gòu)

圖7 Ramachandran圖

2.6 白樺XET基因在不同器官的表達(dá)

通過sqRT－PCR方法分析白樺XET基因在根莖葉3個(gè)器官的表達(dá)情況，首先對(duì)內(nèi)參基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果進(jìn)行定量，通過調(diào)整上樣量，使內(nèi)參基因表達(dá)量均一化，然后依據(jù)調(diào)整后的上樣量對(duì)相應(yīng)的XET基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，如圖8;運(yùn)用Quantity One Analysis Software對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果顯示，XET基因在根、莖和葉3個(gè)器官內(nèi)都有較高的表達(dá)水平，其中在莖中表達(dá)量最高，在葉中表達(dá)量相對(duì)最低。

圖8 白樺XET基因在不同器官的表達(dá)

3 結(jié)論與討論

XET能夠催化木聚糖鏈的裂解來使細(xì)胞壁松弛，在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、擴(kuò)展和重構(gòu)過程中起作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)果實(shí)軟化和木質(zhì)部發(fā)育等，屬于糖基水解酶家族的一員。糖基水解酶家族是一組廣泛存在的，水解兩個(gè)或更多碳水化合物之間或者碳水化合物和非碳水化合物半族之間糖苷接點(diǎn)的酶。本文在XET蛋白家族預(yù)測中找到了一個(gè)糖基水解酶超家族的保守區(qū)和XET C－terminu超家族保守區(qū)，確定所獲得基因?yàn)閄ET基因。運(yùn)用同源模建方法，以原子質(zhì)量為1 μ序列的結(jié)構(gòu)信息為原子模型，構(gòu)建了白樺XET基因編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并利用Swiss－viewer 3.7對(duì)模建結(jié)果進(jìn)行檢測，計(jì)算得出Ramachandran圖。Ramachandran圖是反映立體化學(xué)質(zhì)量(stereochemical quality)的參數(shù)，它通過分析Φ角和Ψ角的分布方式大致評(píng)估模擬的結(jié)構(gòu)是否與自然結(jié)構(gòu)趨勢相同。黃色區(qū)域是最理想的Φ角和Ψ角分布區(qū)域，而藍(lán)色區(qū)域外部則為不合理區(qū)域［14］。由圖7可見，模擬得到的白樺XET蛋白的三維結(jié)構(gòu)的Φ角和Ψ角有95%位于Ramachandran圖中合理區(qū)域，從理論上表明該XET蛋白的三維結(jié)構(gòu)是可靠的。序列決定功能，這為今后研究白樺XET蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

細(xì)胞壁的形態(tài)建成是一系列酶作用的結(jié)果，尤其是細(xì)胞壁修飾酶，有研究表明XET蛋白就是一類重要且與細(xì)胞伸長密切相關(guān)的細(xì)胞壁松弛酶。植物細(xì)胞初生細(xì)胞壁的形成是由同步生長和嵌入生長共同決定的，此時(shí)，編碼細(xì)胞壁修飾酶類的基因會(huì)大量表達(dá)。有研究表明，楊樹中16個(gè)XET基因在發(fā)育的木質(zhì)部中表達(dá)，其中5個(gè)高度表達(dá)，1個(gè)在木質(zhì)部中特異表達(dá)［15］。XET基因在楊樹應(yīng)壓木中表達(dá)量升高，說明其參與了次生細(xì)胞壁形成的生理程序［16］。本研究通過sqRT－PCR方法分析了白樺XET基因在生長中苗木不同器官的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，XET在根，莖和葉中都有較高的表達(dá)水平，說明生長中的根、莖和葉組織正在進(jìn)行細(xì)胞的形態(tài)建成，XET在白樺這3種組織的細(xì)胞壁建成過程中發(fā)揮了作用。此XET基因在白樺根和莖中的表達(dá)水平高于葉組織，而且Chao Wang等［17］研究發(fā)現(xiàn)此白樺XET基因在形成層發(fā)育的不同時(shí)期具有時(shí)序性表達(dá)特性，推測此XET基因與維管組織次生細(xì)胞壁的建成有關(guān)。

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