邢英琦,徐 靜,李 琳,江新梅

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,吉林長春130021)

O2對于所有微生物的生存至關(guān)重要,是維持細(xì)胞內(nèi)能量平衡的有氧代謝必不可少的物質(zhì)。缺氧,是指O2水平低于正常的狀態(tài),可出現(xiàn)于各種生理情況(胚胎發(fā)育、適應(yīng)高海拔、傷口的愈合)與病理情況下(缺血性疾病和癌癥)。缺氧是一系列神經(jīng)疾病(包括卒中、脊髓損傷和外傷性腦損傷)的中心因素,為了適應(yīng)缺氧,微生物出現(xiàn)一系列系統(tǒng)性和局部性的改變以維持O2的平衡,減低缺氧的影響。系統(tǒng)性的改變是增加體內(nèi)血流量以增加氧的運(yùn)輸;局部性改變主要是血管再生;在細(xì)胞水平,最顯著的適應(yīng)缺氧的反應(yīng)是減少氧化磷酸化,增加糖酵解,以增加ATP的產(chǎn)量;在分子水平,主要的調(diào)節(jié)細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的調(diào)控者是缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)。

1 HIF-1的結(jié)構(gòu)

HIF-1是一種隨著細(xì)胞內(nèi)氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子,是一個(gè)異二聚體,由氧調(diào)節(jié)亞單位HIF-1α(120 kDa)和結(jié)構(gòu)亞單位91-94kDa HIF-1β,也稱作芳香烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或ARNT)組成。HIF-1α和HIF-lβ均為基本螺旋-環(huán)-螺線(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族中的成員,并具有Per-ARNTSim(PAS)結(jié)構(gòu)域。PAS結(jié)構(gòu)域含有50多個(gè)氨基酸重復(fù)序列,由His-X-X-Asp基本序列構(gòu)成。bHLH和 PAS結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)DNA的結(jié)合能力并和二聚化作用有關(guān)。α亞單位上其他結(jié)構(gòu)域包括一個(gè)獨(dú)特的O2-依賴降解結(jié)構(gòu)域(ODDD),這是正常氧分壓下HIF-1降解所必須的結(jié)構(gòu);還包括兩個(gè)反式激活結(jié)構(gòu)域(transaction domain,TAD),主要參與轉(zhuǎn)錄激活作用;還包括N-末端活性域(NAD)和C-末端活性域(CAD)。

2 HIF-1的調(diào)節(jié)

在體內(nèi)HIF-1的活性調(diào)節(jié)主要有4個(gè)方面,即HIF-1 mRNA的表達(dá)水平調(diào)節(jié);HIF-1蛋白水平的調(diào)節(jié);HIF-1二聚化和DNA結(jié)合活性的調(diào)節(jié);HIF-1轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)。鐵離子螯合劑、鈷、鎳等金屬及部分抗氧化劑均能使HIF-1表達(dá)增加,但低氧是最主要的生理性HIF-1表達(dá)調(diào)節(jié)因子。

在正常氧濃度條件下,細(xì)胞內(nèi)HIF-1α不穩(wěn)定,半衰期不到5分鐘,很快通過氧依賴降解結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的泛素蛋白酶體降解。在低氧情況下,HIF-1α穩(wěn)定性增加,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,與HIF-1β亞單位結(jié)合成二聚體HIF-1,HIF-1再與目的基因缺氧反應(yīng)元件(HRG)結(jié)合從而激活轉(zhuǎn)錄過程。受HIF-1α調(diào)控的基因稱為HIF-1α的靶基因,這些靶基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子內(nèi)含有一個(gè)或多個(gè)缺氧反應(yīng)元件(HRE),其典型的核苷酸序列為5’-TACGTG-3’,是HIF-1的DNA 結(jié)合位點(diǎn),活化的 HIF-1與之結(jié)合,形成HIF-1、p300/CBP環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB),以及其他轉(zhuǎn)錄因子的起始復(fù)合物,從而啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄[1]。

2.1 HIF-1α穩(wěn)定的調(diào)節(jié)

①PHDs:HIF-α的量由氧依賴性和氧獨(dú)立性機(jī)制調(diào)節(jié)。一方面,缺氧時(shí)α亞單位持續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯,但是另一方面要求隨時(shí)移走HIF-α。在有氧存在時(shí),α亞單位被羥基化,之后迅速降解所以水平很低。激發(fā)羥基化作用的酶叫做HIF-脯氨酰4-羥化酶(PHDs)。PHDs包括 3個(gè)成員:PHD1、PHD2、PHD3,三者具有相近的催化域,屬于2-丙戊二酸(2OG)依賴加氧酶家族。PHD1、2和 3 C-末端催化區(qū)相同,但是N-末端序列不同。PHD1與HIF-1α有最高的特異活性,主要在細(xì)胞核里,而PHD2和PHD3主要在細(xì)胞漿里。為了保持活性,這些酶要求有氧和2OG作為共同反應(yīng)物,Fe2+和抗壞血酸作為輔因子[2,3]。PHDs羥基化人類HIF-1α分子的脯氨酸亞基(pro-564或pro-402),之后羥基化的HIF-1α可以結(jié)合到Von Hippel-Lindau蛋白(pVHL)-E3泛素連接酶復(fù)合物上。PHDs是調(diào)節(jié)HIF-α的關(guān)鍵酶。

②pVHL:羥基化的脯氨酸亞基能使HIF-1被pVHL特異的識(shí)別[4,5]。VHL蛋白,與延伸因子B、延伸因子C、Cul2形成E3泛素連接酶的復(fù)合體,主要在細(xì)胞水平調(diào)節(jié)HIF-1α[6]。VHL是一個(gè)腫瘤抑制基因,本身沒有催化活性。然而它在HIF系統(tǒng)的調(diào)節(jié)及抑制腫瘤進(jìn)展方面扮演重要的角色。pVHL有兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域,α和β,分別與延伸因子 C及HIF-α結(jié)合[7]。染色體中間缺失分析表明pVHL與HIF-1α氧依賴降解域(ODD)相互作用[7-10]。

③泛素連接酶和蛋白酶體:羥基化的HIF-1α與pVHL結(jié)合,繼之泛素化。E2泛素連接酶UbcH5需要 K532、K538和K547受體以使VHL-介導(dǎo)的HIF-1α泛素化。之后,泛素化的HIF-1α轉(zhuǎn)移位置,在26S蛋白酶體內(nèi)降解[6]。

④轉(zhuǎn)錄后修飾:除了羥基化,其他轉(zhuǎn)錄后修飾也影響HIF-1α的穩(wěn)定性。HIF-1α轉(zhuǎn)移到核內(nèi)后的調(diào)整(主要是磷酸化)有助于HIF-1的穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄活性。最近研究發(fā)現(xiàn),在缺氧時(shí)誘導(dǎo)一種蛋白名為“含有RWD sumoylation增強(qiáng)子”,增強(qiáng)低氧時(shí)HIF-1α的SUMO蛋白質(zhì)修飾化,促進(jìn)其穩(wěn)定和轉(zhuǎn)錄活性[11]。

2.2 HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)

①FIH-1:為了實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄活性,HIF復(fù)合物需要結(jié)合到靶基因的HRE調(diào)節(jié)區(qū)。HIF-1α有兩個(gè)活性域,協(xié)同起作用:位于中心區(qū)的NAD-與ODDD重疊,CAD-位于C-末端。CAD的功能主要依賴于轉(zhuǎn)錄共激活子CBP/p300,并且HIF-αCAD與CBP/p300相互作用的調(diào)節(jié)是控制HIF轉(zhuǎn)錄活性的第二個(gè)分子“開關(guān)”。正常氧供下,HIF-1阻滯因子(FIH-1)通過保守氨基酸序列YDCEVNV/AP上N803羥基化(HIF-2α的N847)結(jié)合到HIF-α的C末端,阻滯其與p300/CBP相互作用。門冬酰-羥化酶 FIH-1與 PHDs相似,也需要O2、Fe2+和 2OG 以保持活性。低氧時(shí),阻滯了N803羥基化,允許CAD和CBP/p300上富有半胱氨酸/組氨酸區(qū)域1(CH1)相互作用。

②其他轉(zhuǎn)錄因子競爭性作用:除了通過門冬酰胺羥化控制能否與HIF-αCAD 結(jié)合,HIF-α CAD-CBP/p300相互作用可以被競爭性抑制。因?yàn)楣布せ钭覥BP/p300可與大量轉(zhuǎn)錄因子相互作用,他們結(jié)合的總量是有限的。比如CITED2(以前P35srj/Mrg1)以高親和力與p300/CBP CH1結(jié)合,競爭性抑制其他p300/CBP CH1依賴轉(zhuǎn)錄因子,包括HIF[12]?；罨腜53也能與p300/CBP螯合阻滯HIF功能[13]。

③共刺激子SRC-1與轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)因子2:SRC-1與轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)因子2進(jìn)一步增強(qiáng)HIF-1α轉(zhuǎn)活潛力,并與CBP/p300產(chǎn)生協(xié)同作用[14]。MAP激酶也調(diào)節(jié)HIF的轉(zhuǎn)錄活性,但是確切分子機(jī)制仍有爭議。p42/44和p38MAP激酶均能刺激HIF-α活性,不影響其穩(wěn)定[15]。

表1 HIF-1靶基因

3 HIF-α家族其他成員

除了HIF-1α,HIF-α家族包括另外兩個(gè)成員,HIF-2α(也叫做內(nèi)皮PAS區(qū)域蛋白-1,EPAS-1)和HIF-3α,后兩者有更嚴(yán)格的組織表達(dá)。與HIF-1α相近,低氧時(shí)HIF-2α上調(diào),并通過與缺氧反應(yīng)元件(HRG)結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄。HIF-1α、HIF-2α蛋白只有48%相同處,但是二者都含有保守的氧降解域,均被脯氨酰4-羥化酶調(diào)節(jié)。越來越多的證據(jù)表明HIF-1α、HIF-2α可能有不同的功能[16]。近期的分子遺傳學(xué)研究證明HIF-2α是促紅細(xì)胞生成素的生理性調(diào)節(jié)子,HIF-2α突變引起家族性紅血球增多癥[17]。HIF-3α在調(diào)節(jié)性氧降解域(ODD)上與HIF-1α、HIF-2α有高度相似性,但是缺少HIF-1α、HIF-2αC-末端轉(zhuǎn)錄激活域。低氧時(shí)HIF-3α活性被上調(diào),它與 HIF-1β形成二聚體,并與HRE核心序列相結(jié)合,但是有趣的是,在人的腎臟,HIF-3α作用似乎是抑制缺氧誘導(dǎo)HIF介導(dǎo)的基因表達(dá),因此HIF-3α是缺氧誘導(dǎo)基因表達(dá)的副調(diào)節(jié)因子[18]。

4 HIF-1靶基因

估計(jì)全部HIF靶基因200種-全部人類基因的1-5%,盡管并非全部直接由HREs調(diào)節(jié),其它轉(zhuǎn)錄因子也參與其中。HIF激活的轉(zhuǎn)錄因子DEC1和2、ETS-1也可誘導(dǎo)缺氧基因表達(dá)。缺氧時(shí),常見的應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子,比如AP-1、NF-κ B和Egr1也上調(diào),盡管這些因子對輕度缺氧的敏感性和轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的持久性遠(yuǎn)不如HIF-1。

目前已確認(rèn)HIF途徑直接激活超過70種基因,見表4.1。HIF誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)主要幫助缺氧細(xì)胞的代謝和生存需要。功能包括血管再生、紅血球生成、凋亡、細(xì)胞分化/生存、糖代謝、PH值調(diào)節(jié)和鐵代謝。有趣的是,HIF激活的基因中即有編碼前凋亡蛋白的基因NIP3、BNIP3、Noxa,又有編碼抗凋亡蛋白的基因Mcl-1,這提示前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白的比值不同可能導(dǎo)致細(xì)胞對于缺氧有不同的反應(yīng)。

結(jié)束語:HIF-1是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中扮演重要的角色,因此對HIF-l結(jié)構(gòu)、調(diào)控和靶基因的深入研究,必將為今后的臨床治療提供新的思路和方法。

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