吳豫鄂

(武漢工程大學分析測試中心,湖北 武漢 430074)

0 引 言

飼料中添加適量的尿素可以補充動物生長所需的氮，降低飼養(yǎng)成本，然而過量會導致動物死亡[1].飼料中過量添加尿素對畜牧業(yè)的危害是不容忽視的，對飼料中尿素含量進行監(jiān)控很有必要，但目前我國尚無相應的檢測方法標準.因此，探索飼料中尿素的定量檢測方法具有重要的應用價值.

尿素的測定方法有多種，但由于基體物質(zhì)的干擾都不能直接用于飼料中尿素含量的測定.本研究采用吸附、沉淀與共沉淀的多重分離法對干擾物質(zhì)與尿素進行分離，通過優(yōu)化分離條件使分離率達到90%以上.用對二甲氨基苯甲醛光度法對分離樣液中的尿素進行定量測定[2- 3]，準確地檢測出了飼料中尿素的含量.

1 實驗部分

1．1 儀器

德國天平METTLFTR TOLEDO AB104-S/FACT；美國惠普紫外可見分光光度計HP-8452A；德國超純水系統(tǒng)Sartorius stedim arium?611UV；上海電熱恒溫箱DHG-9070A.

1．2 試劑

尿素標準溶液；對二甲氨基苯甲醛(DMAB)溶液；磷酸鹽緩沖溶液(pH7.0)；亞鐵氰化鉀溶液；乙酸鋅溶液；活性碳；市售飼料.

1．3 實驗方法

1．3．1 干擾物質(zhì)的分離 稱取預先粉碎至篩分0.85 mm以下的樣品1～2 g(精確到0.1 mg)至100 mL小燒杯中，加入1 g活性碳，加水25 mL，迅速加入5 mL乙酸鋅溶液，攪拌2 min，再加入5 mL亞鐵氰化鉀溶液，攪拌5 min，用質(zhì)量分數(shù)3%的乙酸將pH值調(diào)到5左右，40～50 ℃保溫放置2 h.用定量濾紙過濾，水洗，洗濾液承接于100 mL容量瓶中，定容.同時做試劑空白試驗.

1．3．2 標準曲線的繪制 分別取1 mg·mL-1或0.2 mg·mL-1的尿素標準溶液(視樣品中尿素含量而定)0、1、2、3、4、5 mL于25 mL具塞比色管中，加入5 mL磷酸鹽緩沖液，加水至約15 mL，加入5 mL DMAB顯色液，用水稀釋至刻度，搖勻，15～35 ℃放置20 min，在420 nm波長下，用1 cm或3 cm比色池測定，以吸光度為縱坐標，尿素含量為橫坐標作曲線圖.

1.3.3 尿素含量的測定 取樣品濾液5～15 mL加入25 mL具塞比色管中，其他步驟同1.3.2，查標準曲線計算尿素含量.

2 結(jié)果與討論

2．1 乙酸鋅、亞鐵氰化鉀對有機干擾物的分離效果

本研究用乙酸鋅作沉淀劑分離樣品溶液中的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸[4]；用亞鐵氰化鉀與過量的乙酸鋅反應生成膠性氰亞鐵酸鋅沉淀[5]，此膠性沉淀既可去除過量的乙酸鋅，又有共沉淀蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸絡合物的作用，還能吸附沉淀微粒使濾液澄清透明.分離效果見圖1.

圖1 分離效果比較圖

圖1是不含尿素的飼料樣品經(jīng)不同處理所得濾液的紫外-可見光譜掃描圖.a是飼料水溶液濾液的掃描圖，b是飼料經(jīng)活性碳處理后濾液的掃描圖，c是飼料經(jīng)活性碳、乙酸鋅和亞鐵氰化鉀處理后濾液的掃描圖.a處理得到的濾液有較深的黃色，在210～420 nm之間有很強的吸收,說明其中含有豐富的有機物.b處理得到無色略帶混濁的濾液，在420 nm的吸收接近于零，在300 nm附近有很強的吸收，加入DMAB后在420 nm處的吸收顯著高于試劑空白.說明此處理對色素的分離效果很好，分離蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等物質(zhì)的效果較差.c處理得到無色透明的濾液，在420 nm的吸收接近于零, 在300 nm附近有微弱的吸收，加入DMAB后在420 nm處的吸收與試劑空白無明顯差異.說明該處理對色素、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸等有機物質(zhì)有很好的分離效果.

2．2 活性碳的脫色效果及使用粒度、使用量的選擇

活性碳是良好的吸附劑，對非極性和弱極性有機物有較強吸附力，脫色效果很好[6]，見圖1.活性炭顆粒的大小，對測定結(jié)果有影響.粒度大，與溶液中的色素分子的接觸的表面積相對較小，吸附效果欠佳；粒度小，過濾時間較長；當粒徑過小時，會發(fā)生活性炭微粒的穿濾，穿濾的微粒在420 nm有吸收，對光度分析產(chǎn)生干擾，所以選用0.25～0.15 mm粒徑的活性炭.

從理論上講，隨著活性炭用量增加脫色效果會增強，但是活性炭的用量過大會造成洗濾困難，在對洗濾體積有一定要求的情況下，樣品中的尿素不能被完全洗出，導致測定結(jié)果偏低.經(jīng)實驗，稱取2 g樣品加入1 g活性炭能得到滿意的效果.

2．3 溫度對吸附分離色素的影響

溫度對吸附效果有顯著影響[7].

用色值測定計算吸附分離色素的效果(脫色率)：以去離子水為背景，420 nm下，1 cm的比色杯測定吸光度.

按1.3.1方法，在不同溫度下制取樣品脫色液，測定濾液的色值并轉(zhuǎn)換成脫色率.溫度對脫色效果的影響見圖2.

由圖2可見，脫色率與溫度成正相關，超過50 ℃變化趨緩.考慮到40～50 ℃時的脫色率已滿足實驗要求，且溫度過高會使尿素水解，選擇40～50 ℃為最佳溫度.

圖2 溫度對脫色效果的影響

2．4 時間對分離效果的影響

吸附反應達到平衡需要時間，沉淀與共沉淀完成生成、陳化、沉降的過程也需要時間，時間對分離效果有較大的影響[7].實驗表明，隨著時間的延長脫色效果顯著變好，但2 h以后變化趨緩，選擇2 h的分離時間既能取得良好的分離效果，又能相對提高分離效率，見圖3.

圖3 時間對脫色效果的影響

2．5 pH值對吸附分離色素的影響

用1.3.1方法制備6份實驗樣品，將其調(diào)節(jié)到不同的pH值，測定濾液的色值并轉(zhuǎn)換成脫色率.實驗表明，脫色率隨著pH增大而降低，pH4～5時脫色率達90%以上，能滿足實驗要求，見圖4.選擇pH4～5為最佳酸度.

圖4 pH值對脫色效果的影響

2．6 其它非蛋白含氮物質(zhì)對測定干擾的研究

除尿素以外，硫酸銨、三聚氰胺、縮二脲也可能被加入到飼料中充作氮源.實驗表明，這些物質(zhì)不與DMAB發(fā)生顯色反應，對測定尿素不產(chǎn)生干擾，見圖5.

圖5 幾種物質(zhì)與DMAB顯色后的紫光可見光譜圖

圖5是硫酸銨、三聚氰胺、縮二脲等加入DMAB顯色后的紫外-可見光譜掃描圖.曲線B是5 mL DMAB顯色劑的試劑空白掃描圖；曲線V1是200 μɡ·mL-1硫酸銨加入5 mL DMAB顯色后的掃描圖；曲線E1是200 μɡ·mL-1縮二脲加入5 mL DMAB顯色后的掃描圖；曲線F1是200 μɡ·mL-1三聚氰胺加入5 mL DMAB顯色后的掃描圖；曲線I1是200 μɡ·mL-1尿素加入5 mL DMAB顯色后的掃描圖.由圖5可見，420～470 nm處硫酸銨、縮二脲、三聚氰胺與DMAB試劑空白的吸收圖形沒有區(qū)別，而尿素在此處有明顯的吸收.在420 nm處，DMAB試劑空白、硫酸銨、縮二脲、三聚氰胺、尿素加入DMAB顯色后的吸光度分別是0.343，0.345，0.350，0.355，0.853，扣除試劑空白后硫酸銨、縮二脲、三聚氰胺沒有吸收，尿素有0.51吸光度的吸收.

2．7 適合測定的含量范圍

對二甲氨基苯甲醛光度法測定尿素線性相關性好，靈敏度不高.實驗的回歸曲線為y=0.112 9x+0.001 1,相關系數(shù)r=0.999 8，40 μg·mL-1尿素的吸光度為0.113.考慮到稱樣量和分取體積等因素，建議本法適用于尿素質(zhì)量分數(shù)在0.2%以上的飼料產(chǎn)品.

2．8 實驗中須注意的問題

飼料原材料豆粕中含有尿素酶，遇水會使尿素分解.因此當樣品加入活性碳和水后，要迅速加入乙酸鋅，使尿素酶沉淀失活，以免樣品中的尿素被分解.

2．9 實驗結(jié)果的準確性和重復性

取100 g不含尿素的飼料，加入質(zhì)量分數(shù)大于99.0%的分析純尿素2 g，充分混均，用1.2所述方法進行重復測定.尿素的平均回收率達到99.9%，實驗的重現(xiàn)性良好，RSD為3.0%，見表1.

表1 回收實驗結(jié)果

3 結(jié) 語

用活性碳吸附色素，乙酸鋅和亞鐵氰化鉀沉淀共沉淀蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸，此多重分離的方法可以使飼料中的尿素與復雜的基體物質(zhì)得到良好的分離.樣品中加入分離劑后，在pH5左右的酸性條件下，于40～50 ℃靜置2 h，用水淋洗分離，分離效果能達到90%以上.用對二甲氨基苯甲醛光度法對分離后的樣液中的尿素進行定量分析，回收率可達到99.9%，重復實驗的RSD為3.0%.

參考文獻：

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[3] 李川江,李珂,喬澍,等.對二甲氨基苯甲醛比色法測定微量尿素的改進[J].四川師范大學學報：自然科學版,2010,33(3):410-412.

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[6] 戴衛(wèi)東，錢禮華，汪守建.活性炭吸附棉籽糖液中色素的工藝研究[J].食品科技,2009,34(9):213-216.

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