黃芬香，楊春艷，龐春英，鄭海英，尚江華，張秀芳，梁賢威

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西水牛遺傳繁育重點實驗室，廣西 南寧530001）

近年來，隨著水牛產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，商業(yè)性良種水牛胚胎的需求迅速加大。應(yīng)用活體采卵技術(shù)生產(chǎn)良種水牛胚胎，可反復(fù)從優(yōu)良性狀母畜體內(nèi)采集遺傳背景清楚的卵母細(xì)胞生產(chǎn)胚胎，充分發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力。但由于活體采卵技術(shù)回收到的良種水牛卵母細(xì)胞數(shù)量有限，且在活體采卵的過程中，通過真空泵的抽吸，不可避免地由于負(fù)壓的的作用剝脫卵母細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞而產(chǎn)生較多的裸卵。在活體采卵回收到的卵母細(xì)胞中，卵母細(xì)胞可用率為70.92%，裸卵平均占回收總卵數(shù)的16.33%［1］。在這些裸卵中的一部分可能是AB級卵由于負(fù)壓作用剝脫而形成的，具有成熟發(fā)育的潛力，受精后仍能有發(fā)育成胚胎的可能。因此，若能將這些裸卵在體外培養(yǎng)成熟進(jìn)行受精，可增加活體采集可用卵母細(xì)胞的數(shù)量，使卵母細(xì)胞資源得以充分利用，以提高良種水?；铙w采卵——體外生產(chǎn)胚胎的效率。眾所周知，水牛體外受精是模擬體內(nèi)受精卵、胚胎發(fā)育條件和環(huán)境來進(jìn)行的，過程復(fù)雜，體外受精效果受諸多因素的影響。研究發(fā)現(xiàn)，卵丘細(xì)胞的存在與否嚴(yán)重影響卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量［2，3］及隨后的胚胎發(fā)育能力［4］。而在受精卵發(fā)育到胚胎的過程中，顆粒細(xì)胞具有重要的作用，與顆粒細(xì)胞制備的單層共培養(yǎng)可增強(qiáng)卵母細(xì)胞體外受精后發(fā)育到囊胚的能力［5］。本研究以屠宰本地水牛卵母細(xì)胞為研究對象，旨研究卵丘細(xì)胞對卵母細(xì)胞（包括裸卵）的體外成熟率、分裂率、囊胚發(fā)育率以及對比了不同牛品種顆粒細(xì)胞單層對水牛體外受精胚胎發(fā)育的影響，以探討裸卵利用的可能性，為提高良種水牛體外胚胎生產(chǎn)效率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源與保存

水牛卵巢來自廣西南寧市屠宰場的成年母水牛卵巢，屠宰母水牛后取出卵巢，保存于35～37℃含有青、鏈霉素的生理鹽水保溫瓶中，在3h內(nèi)運(yùn)回實驗室。水牛精液購自廣西畜禽品種改良站，保存于－196℃的液氮中。

1.2 試驗試劑

試劑均購自Sigma公司。洗卵液為含5%新生牛血清（NBS）和20mmol/L Hepes的 TCM199；體外成熟液為TCM199＋10%胎牛血清（FBS）＋50 μM 半胱胺＋10μg/mL FSH＋12U/mL LH＋1 μg/mL E2；洗 精 液 采 用 含 0.3% 牛 血 清 白 蛋 白（BSA）的改良 Tyrode＇S液；受精液為0.6%BSA＋60μg/mL肝素鈉的改良Tyrode＇S液；胚胎培養(yǎng)液為10%NBS＋TCM199。

1.3 試驗方法

以本實驗室建立的水牛卵丘卵母細(xì)胞的IVM、IVF和IVC 為基礎(chǔ)試驗方法［6，7］。

1.3.1 卵母細(xì)胞的收集 采用卵泡穿刺法從直徑2～8mm的明亮卵泡中吸取卵母細(xì)胞。在體視顯微鏡下挑選形態(tài)正常，周圍有完整或部分卵丘細(xì)胞且細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞以及形態(tài)正常的無卵丘卵母細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)。

1.3.2 卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) 將清洗好的卵母細(xì)胞移入成熟培養(yǎng)液中，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中5%CO2、38℃條件下培養(yǎng)22～24h。取出部分COCs，用0.2%透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞，觀察生發(fā)泡破裂和第一極體排出的情況，計算卵母細(xì)胞的成熟率。

1.3.3 體外受精 用受精液在培養(yǎng)皿中做20μL的受精微滴，上覆石蠟油，放入CO2培養(yǎng)箱中預(yù)熱平衡2h。精子上游法獲取活精子，待用。去除包裹在成熟卵母細(xì)胞周圍的部分卵丘細(xì)胞，只留1～2層。用受精液洗滌卵母細(xì)胞2～3次。將洗滌后的卵母細(xì)胞放入受精微滴中，每滴放入10個卵母細(xì)胞，再加入精子懸液，使得精子濃度為1.0～2.0×106個/mL。將含精卵的培養(yǎng)皿放回CO2培養(yǎng)箱中孵育20～24h。

1.3.4 胚胎的體外培養(yǎng) 精卵共育20～24h后，將受精卵周圍殘留的卵丘細(xì)胞吹打干凈，用胚胎培養(yǎng)液洗滌2次，轉(zhuǎn)入顆粒細(xì)胞單層微滴中置CO2培養(yǎng)箱，5%CO2、38.5℃和100%濕度條件下培養(yǎng)，20～24h后檢查分裂情況，培養(yǎng)過程中每隔48h半量更換培養(yǎng)液，每隔24h觀察胚胎發(fā)育情況。

1.3.5 試驗設(shè)計

試驗1：卵丘細(xì)胞對水牛卵母細(xì)胞體外受精及其胚胎發(fā)育的影響

將收集到的水牛卵母細(xì)胞分五組進(jìn)行成熟培養(yǎng)。Ⅰ組為自然裸卵組：無卵丘細(xì)胞的AB級卵母細(xì)胞單獨進(jìn)行成熟培養(yǎng)；Ⅱ組為共成熟組：無卵丘的AB級卵母細(xì)胞與顏色透明的片狀卵丘細(xì)胞塊進(jìn)行成熟共培養(yǎng)；Ⅲ組為人為裸卵組：包裹卵丘細(xì)胞的AB級卵母細(xì)胞人為去除卵丘細(xì)胞后與顏色透明的片狀卵丘細(xì)胞塊進(jìn)行成熟共培養(yǎng)。Ⅳ組為非裸卵組：包裹卵丘細(xì)胞的AB級卵母細(xì)胞進(jìn)行體外成熟后去除卵丘細(xì)胞再進(jìn)行體外受精，Ⅴ組為對照組，即包裹卵丘細(xì)胞的AB組卵母細(xì)胞單獨進(jìn)行成熟培養(yǎng)。在各培養(yǎng)組的卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)22h后計算成熟率并進(jìn)行體外受精及后續(xù)胚胎培養(yǎng)。

試驗2：不同牛品種顆粒細(xì)胞單層對受精卵共培養(yǎng)效果的比較。

AB級卵母細(xì)胞經(jīng)IVM、IVF后，在其受精20h后將假定受精的卵子分為兩組，分別與水牛、黃牛的顆粒細(xì)胞單層進(jìn)行共培養(yǎng)。

水牛顆粒細(xì)胞單層的制備：從水牛卵巢回收液中挑選光澤度好、細(xì)胞致密的大塊顆粒細(xì)胞片，離心洗滌后將收集的顆粒細(xì)胞用胚胎培養(yǎng)液制成細(xì)胞密度為（1～2）×106個/mL的懸浮液，在60×15mm的塑料培養(yǎng)皿中做成30μL的微滴，并覆蓋石蠟油。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后備用。

黃牛顆粒細(xì)胞單層：從屠宰場收集到的牛卵巢回收的卵泡液中挑選光澤度好、細(xì)胞致密的顆粒細(xì)胞碎片，培養(yǎng)液清洗2遍后，加入25%胰酶吹打1 min，離心（2500r/min，5min）洗滌2次，用胚胎培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為（1～2）×106個/mL，在60×15mm的塑料培養(yǎng)皿中做成30μL的微滴，并覆蓋石蠟油。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長成單層后備用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 卵丘細(xì)胞對水牛卵母細(xì)胞體外受精及其胚胎發(fā)育的影響

從表1可以看出，各培養(yǎng)組卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)22～24h后，在成熟率方面，自然裸卵組（Ⅰ組）與共成熟組（Ⅱ組）無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于人為裸卵組（Ⅲ組）（P＜0.05），極顯著低于非裸卵組（Ⅳ組）、對照組（Ⅴ組）（P ＜0.01）；共成熟組（Ⅱ組）較自然裸卵組（Ⅰ組）略有提高；人為裸卵組（Ⅲ組）與共成熟組（Ⅱ組）、非裸卵組（Ⅳ組）、對照組（Ⅴ組）均無明顯差異（P＞0.05），但顯著高于自然裸卵組（Ⅰ組）（P＜0.05）。在分裂率方面，自然裸卵組（Ⅰ組）、共成熟組（Ⅱ組）與人為裸卵組（Ⅲ組）無顯著差異（P＞0.05），但自然裸卵組（Ⅰ組）與非裸卵組（Ⅳ組）、對照組（Ⅴ組）差異極顯著（P＜0.01）。在囊胚率方面，自然裸卵組（Ⅰ組）極少出現(xiàn)胚胎，但與卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)后囊胚率顯著提高（P＜0.05）；人為裸卵由于系人為去除卵丘細(xì)胞致裸卵，因此發(fā)育潛能明顯優(yōu)于自然裸卵（P＜0.01），但與Ⅱ組無差異；非裸卵組（Ⅳ組）因是由AB級卵經(jīng)成熟后去除卵丘細(xì)胞授精，效果優(yōu)于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組，但這四組的囊胚率均極顯著差于對照組（Ⅴ組）（P＜0.01）。這表明，卵丘細(xì)胞無論是在體外成熟或是體外受精的過程中都起著舉足輕重的作用，但相對自然裸卵而言，雖然在與卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)后成熟率、分裂率、囊胚率略有提高卻未能夠取得較理想的培養(yǎng)效果。

表1 卵丘細(xì)胞對水牛卵母細(xì)胞體外受精及其胚胎發(fā)育的影響

2.2 不同牛品種共培養(yǎng)細(xì)胞對水牛受精卵發(fā)育的影響

從表2可以看出，正常AB級卵母細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)體外成熟和體外受精后，受精卵分別與黃牛顆粒細(xì)胞單層和水牛顆粒細(xì)胞單層進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同品種顆粒細(xì)胞單層的分裂率和囊胚率差異顯著，水牛顆粒細(xì)胞單層的分裂率和囊胚率均明顯高于黃牛的（P＜0.05）。結(jié)果表明，應(yīng)用本培養(yǎng)系統(tǒng)，采用水牛顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)組的效果較優(yōu)于黃牛顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)組。

表2 不同牛品種共培養(yǎng)細(xì)胞對水牛受精卵發(fā)育的影響

3 討論

在水牛胚胎的體外生產(chǎn)中，卵丘細(xì)胞對于卵母細(xì)胞成熟有極其重要的作用［8］，主要表現(xiàn)在卵丘細(xì)胞參與維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂阻滯，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)、支持卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的成熟［9］，并進(jìn)而提高其受精后的卵裂率和發(fā)育率。已有實驗表明，在體外成熟的過程中，一些生長因子能不同程度地促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟，提高成熟卵繼續(xù)發(fā)育的能力，但生長因子的作用，必須由卵丘細(xì)胞縫隙連接介導(dǎo)，對裸卵無作用［10］。本實驗研究也發(fā)現(xiàn)，自然裸卵在正常情況下培養(yǎng)，極少出現(xiàn)囊胚，但其與卵丘細(xì)胞共培養(yǎng)后，在成熟率、分裂率、囊胚率方面有所提高；機(jī)械裸卵，即假定的回收裸卵中的一部分，其有可能是卵母細(xì)胞回收過程中由于外部原因人為地打光卵丘細(xì)胞所致，這一部份機(jī)械致光的卵比自然裸卵更有發(fā)育潛力，因此，其發(fā)育效果較優(yōu)于自然裸卵。研究也證實了卵丘細(xì)胞不僅只是在體外成熟的過程中起著決定性的作用，在體外受精的過程中也發(fā)揮著重大作用，這也與 Fatechi［4］和 Li［11］等試驗證明卵丘細(xì)胞的存在有利于卵母細(xì)胞體外成熟及受精后發(fā)育的結(jié)論一致。非裸卵組，在AB級卵母細(xì)胞常規(guī)體外成熟后，機(jī)械打光后受精，雖然其發(fā)育結(jié)果比自然裸卵、自然裸卵共培養(yǎng)和機(jī)械裸卵要好，但仍然比對照組有較顯著的差異，這與在牛上的試驗結(jié)果基本一致［12］。其次，卵母細(xì)胞周圍的卵丘顆粒細(xì)胞能幫助精子獲能和穿入卵母細(xì)胞［13］，能夠明顯提高受精胚胎的發(fā)育［14，15］。因此本試驗的卵母細(xì)胞在受精時包裹卵丘細(xì)胞與成熟后打光卵丘細(xì)胞受精相比，明顯提高了水牛體外受精的卵裂率和囊胚率。

利用顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)，有利于水牛體外受精卵的發(fā)育，但不同牛品種的顆粒細(xì)胞單層培養(yǎng)效果有所差異，這在本試驗中也得到了證實，應(yīng)用水牛顆粒細(xì)胞單層的共培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于黃牛顆粒細(xì)胞單層的培養(yǎng)效果。究其原因可能為，同科不同屬的顆粒細(xì)胞所產(chǎn)生的肝素結(jié)合細(xì)胞因子（midkine）和其它一些細(xì)胞因子對水牛胚胎體外發(fā)育能力雖然都有促進(jìn)作用，都能除去培養(yǎng)液中某些對水牛胚胎發(fā)育不利的毒性代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的氧張力而阻止氧化應(yīng)激，穩(wěn)定培養(yǎng)液的各種生化參數(shù)，使水牛胚胎在一個相對穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境中生長發(fā)育［16］，但作用與其在同屬的顆粒細(xì)胞各不相同，卵母細(xì)胞或者在與其相對應(yīng)的科屬的顆粒細(xì)胞單層中共培養(yǎng)效果更好。

4 結(jié)論

綜合結(jié)果看出，卵丘細(xì)胞雖對裸卵的體外成熟培養(yǎng)及其受精分裂效果沒有明顯的改進(jìn)作用，但能顯著提高其囊胚率；卵丘細(xì)胞在AB級卵母細(xì)胞受精過程中的促進(jìn)作用能顯著提高囊胚率。說明卵丘細(xì)胞有助于水牛卵母細(xì)胞的體外成熟、體外受精及其胚胎發(fā)育；在受精卵培養(yǎng)過程中，應(yīng)用同科屬的水牛顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)效果明顯優(yōu)于黃牛顆粒細(xì)胞單層的效果。

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