江學(xué)斌 張敏靜 林健聰 梁世中

抗菌肽（antibacterial peptide）是一類在一定誘導(dǎo)條件下，由宿主細(xì)胞特定編碼基因產(chǎn)生的對抗外源性病原微生物的小分子肽類活性物質(zhì)。經(jīng)研究表明，抗菌肽具有分子量小、穩(wěn)定性好、無免疫原性等特點(diǎn)，具有廣譜的抗菌、抗病毒作用，在生物體的自然免疫中具有重要的防御和保護(hù)作用。天蠶素 (Cecropins)是由Boman等[1]從惜古比天蠶蛹中誘導(dǎo)分離獲得，由37～39個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約4000 Da，包括Cecropin A、Cecropin B、Cecropin C、Cecropin D 等，是目前研究背景最為清晰、作用效果較好的一類抗菌肽。而抗菌肽Cecropin AD（CAD）是由cecropin A的N端1～11肽段和cecropin D的C端12～37肽段組成的雜合肽，呈線性陽離子α螺旋構(gòu)型，其殺菌活性和抗菌譜明顯優(yōu)于cecropin A和cecropin D[2]，具有無殘留毒性和病原體難以產(chǎn)生耐藥性的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。

抗菌肽被認(rèn)為是目前最有發(fā)展前景的天然多肽抗生素和綠色飼料添加劑。與傳統(tǒng)抗生素相比，抗菌肽不僅具有廣譜的抗菌活性，穩(wěn)定性高，而且不易導(dǎo)致耐藥性菌株產(chǎn)生[3]。而抗生素作為飼料添加劑使用容易破壞動物胃腸道微生物平衡，在動物體內(nèi)殘留，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量；同時(shí)，濫用抗生素易產(chǎn)生多耐藥性菌株，從而導(dǎo)致難以控制的大面積動物疫情。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抗菌肽可提高動物抗病能力，促進(jìn)動物生長[4－7]，而且不容易產(chǎn)生耐藥性，具有替代傳統(tǒng)飼用抗生素的潛能。然而，由于抗菌肽在生物體內(nèi)含量極少，難以大量提取獲得；而其分子量小，對表達(dá)宿主具有抑制和殺傷作用，因此，抗菌肽的規(guī)?；a(chǎn)仍是目前限制抗菌肽應(yīng)用的首要瓶頸。

本研究采用基因工程技術(shù)，在畢赤酵母中通過組成型分泌到胞外的方式表達(dá)抗菌肽Cecropin AD，并進(jìn)行抗菌肽Cecropin AD組成型表達(dá)的50 L發(fā)酵罐規(guī)模中試研究，研究其體外抗菌活性和抗菌譜，為抗菌肽的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用提供前期基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

酵母表達(dá)菌株P(guān)ichia pastoris X－33、含抗菌肽CAD基因片段的質(zhì)粒pUC－CAD、真核表達(dá)質(zhì)粒pGAPZα－A、大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌 ATCC25923、金黃色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草桿菌、綠膿桿菌ATCC27853等均由廣州大學(xué)生物工程研究所保存。

1.1.2 工具酶和試劑

限制性內(nèi)切酶Xba I、Xho I和Sca I，質(zhì)粒小量提取試劑盒、T4DNA連接酶、DNA膠回收試劑盒、DNA聚合酶、Zeocin等購自中國大連寶生物工程有限公司；PCR引物由廣州英濰捷基公司生物技術(shù)有限公司合成。其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)抗菌肽CAD基因序列，設(shè)計(jì)并合成兩條上下游特異性引物（見表1）。以pUC－CAD為模板，利用PCR擴(kuò)增的方法獲得編碼抗菌肽CAD的DNA片段，該片段的兩端分別含有Xho I和Xba I酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增得到的基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶雙酶切后連接到pGAPZα－A上，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGAPZαA－CAD并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，Zeocin抗性篩選重組轉(zhuǎn)化子并送廣州英濰捷基公司生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測定。

表1 擴(kuò)增目的基因PCR引物

1.2.2 重組質(zhì)粒對酵母宿主菌X33的轉(zhuǎn)化

制備畢赤酵母菌株X33的感受態(tài)細(xì)胞，取80 μl與10 μg Avr II單酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒pGAPZα－A－CAD混勻，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化（25 μF，1500 V），29 ℃溫育1 h后，將菌液涂在含有100 μg/ml Zeocin抗生素的YPD固體培養(yǎng)基平板上，29℃恒溫培養(yǎng)2～4 d，篩選出陽性菌落。同時(shí)，將Avr II線性化的pGAPZα－A空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母，制備的pGAPZα－A轉(zhuǎn)化X33菌株作為空白對照。挑取平板上的轉(zhuǎn)化子，振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集菌體進(jìn)行PCR鑒定，以X33/pGAPZα－A培養(yǎng)上清為陰性對照，篩選出整合有目的基因的重組子。

1.2.3 重組抗菌肽Cecropin AD的表達(dá)

將PCR鑒定得到的陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子X33/pGAPZαA－CAD分別接種到10 ml YPD培養(yǎng)基中29℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)96 h后，離心收集培養(yǎng)上清。以 X33/pGAPZα－A 培養(yǎng)上清為對照，Tricine－SDSPAGE檢測培養(yǎng)上清中重組蛋白的分泌表達(dá)情況。

1.2.4 重組抗菌肽Cecropin AD的初步抗菌活性測定

采用瓊脂孔穴擴(kuò)散法，以金黃色葡萄球菌ATCC 25923為實(shí)驗(yàn)菌株，將金黃色葡萄球菌懸浮液（OD600=0.5～0.6）50 μl與 46 ℃的 LB 固體培養(yǎng)基 100 ml混勻后鋪平板，待其凝固后4℃保存，用無菌打孔器（直徑8 mm）打孔，每孔中滴加經(jīng)100℃加熱處理10 min的待測培養(yǎng)上清100 μl，待孔中液體被培養(yǎng)基吸收完全后，上述平板37℃倒置培養(yǎng)過夜（10～12 h）。以同體積的X33/pGAPZα－A培養(yǎng)上清為陰性對照，氨芐青霉素（Ampicillin，Amp）為陽性對照，第2 d測量抑菌直徑，抑菌圈直徑(mm)=測量直徑－孔徑(即8 mm)。

1.2.5 抗菌肽Cecropin AD的中試發(fā)酵

一級種子：上述篩選得到的抗菌活性最強(qiáng)的重組菌株甘油菌種，取0.5 ml接入含YPD培養(yǎng)基20 ml的100 ml錐形瓶中，29℃、250 r/min培養(yǎng)10 h；二級種子：按5%的接種量接入含YPD培養(yǎng)基250 ml的1 L錐形瓶中，同樣條件下培養(yǎng)10 h；三級種子：按10%的接種量接入含有YPD培養(yǎng)基3 L的5 L發(fā)酵罐，同樣條件下培養(yǎng)約10 h。

50 L罐發(fā)酵：培養(yǎng)在50 L發(fā)酵罐中進(jìn)行，發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基為30 L的YPD培養(yǎng)基，接種前校正pH值電極和溶氧電極，培養(yǎng)過程中保持通氣量大于60 L/min，發(fā)酵過程中菌體利用葡萄糖產(chǎn)酸，用KOH溶液調(diào)節(jié)pH值5.5，培養(yǎng)溫度設(shè)定為29.0℃，起始轉(zhuǎn)速為150 r/min，隨著菌體的生長不斷提高轉(zhuǎn)速，發(fā)酵過程中控制溶氧大于30%，培養(yǎng)48 h后放罐。每2 h取少量發(fā)酵液，測定其菌體濕重、葡萄糖含量以及抑菌活性。轉(zhuǎn)速、溫度、pH值和溶氧等參數(shù)由發(fā)酵罐自動檢測，記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 抗菌肽Cecropin AD的中試發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性測定

參照1.2.4節(jié)的方法，以同體積的X33/pGAPZα－A培養(yǎng)上清為陰性對照，氨芐青霉素為陽性對照，測定抗菌肽Cecropin AD的中試發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌 DH5α、金黃色葡萄球菌ATCC25923、金黃色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草桿菌、綠膿桿菌ATCC27853的抗菌活性。

2 結(jié)果

2.1 重組克隆載體的構(gòu)建與鑒定

以pUC－CAD為模板，利用上下游特異性引物F和R，通過PCR方法獲得編碼抗菌肽CAD蛋白的DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在120 bps附近得到目的條帶，與預(yù)期大小相符（見圖1）。PCR擴(kuò)增得到的基因片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶（Xho I和Xba I）雙酶切后連接到pGAPZα－A上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，Zeocin抗性篩選重組轉(zhuǎn)化子并送廣州英濰捷基公司生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測定，測序結(jié)果顯示，所得到編碼重組蛋白CAD的DNA序列與預(yù)期一致（資料未顯示）。

挑取抗性平板上的轉(zhuǎn)化子，29℃、250 r/min，振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集菌體進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖2，所挑取重組子均呈PCR陽性。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2 PCR篩選重組酵母

2.2 重組抗菌肽Cecropin AD的表達(dá)和初步活性測定

挑取上述PCR鑒定呈陽性的重組轉(zhuǎn)化子分別接種到10 ml YPD培養(yǎng)基中29℃，250 r/min振蕩培養(yǎng)96 h后，離心收集上清。培養(yǎng)上清的Tricine－SDS－PAGE檢測結(jié)果表明，與X33/pGAPZα－A培養(yǎng)上清相比，重組子培養(yǎng)上清在4.0kDa處均有一明顯的蛋白條帶 (見圖3)，與抗菌肽Cecropin AD的理論分子一致。瓊脂孔穴擴(kuò)散法測定重組子抗菌活性結(jié)果也顯示 (見圖4)，經(jīng)加熱處理的重組子培養(yǎng)上清對金黃色葡萄球菌ATCC25923具有顯著抑制作用，而同樣處理的對照菌株X33/pGAPZα－A的培養(yǎng)上清則未見明顯抑菌圈。

2.3 重組抗菌肽Cecropin AD的中試發(fā)酵

經(jīng)Tricine－SDS－PAGE和瓊脂孔穴擴(kuò)散法篩選得到工程菌X－33/pGAPZαA－CAD，通過種子活化和三級種子擴(kuò)增后，轉(zhuǎn)入50 L發(fā)酵罐進(jìn)行中試發(fā)酵研究。如圖5所示，工程菌Pichia pastoris X－33/pGAPZαA－CAD接種后 0～8 h，菌體濕重（wet weight）緩慢增加，處于適應(yīng)期，8 h后，菌體開始快速生長進(jìn)入指數(shù)生長期，利用葡萄糖產(chǎn)酸導(dǎo)致pH值下降，緩慢流加KOH維持pH值在5.5左右。至發(fā)酵12 h時(shí)，發(fā)酵液開始檢測到抗菌活性，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，抗菌活性增強(qiáng)，42 h后，抗菌肽CAD的表達(dá)開始進(jìn)入平臺期，抗菌活性增長緩慢，至48 h，抗菌活性達(dá)到最大，停止發(fā)酵，收獲培養(yǎng)上清。

圖3 重組抗菌肽Cecropin AD表達(dá)產(chǎn)物的Tricine－SDS－PAGE 分析

圖4 重組抗菌肽Cecropin AD表達(dá)產(chǎn)物的抗菌活性測定

瓊脂孔穴擴(kuò)散法試驗(yàn)結(jié)果也顯示 (見圖6)，36和48 h發(fā)酵液上清經(jīng)100℃加熱處理10 min后對金黃色葡萄球菌ATCC25923均有明顯的抑殺作用；但100 μl培養(yǎng)48 h的發(fā)酵液上清對金黃色葡萄球菌ATCC 25923的抑菌圈直徑(減去孔徑8 mm)可達(dá)17.8 mm，抑菌活性明顯優(yōu)于2 μg的陽性對照Amp(11.5 mm)。

圖5 Pichia pastoris X－33/pGAPZαA－CAD 發(fā)酵的菌重與抑菌活性的變化

圖6 重組抗菌肽Cecropin AD發(fā)酵液的抑菌活性

2.4 重組抗菌肽Cecropin AD中試發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌活性檢測

50L發(fā)酵收獲的上清，經(jīng)100℃加熱處理10 min后，分別取100 μl檢測發(fā)酵上清對大腸桿菌ATCC25922、大腸桿菌DH5α、金黃色葡萄球菌 ATCC25923、金黃色葡萄球菌 MRSA 5636、枯草桿菌、綠膿桿菌的抗菌活性，結(jié)果見表2，重組抗菌肽Cecropin AD發(fā)酵上清對供試菌的敏感程度依次為：枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌ATCC 25923、大腸桿菌 ATCC 25922＞大腸桿菌DH5α、耐藥性金黃色葡萄球菌 MRSA 5636＞綠膿桿菌ATCC27853。

3 討論

近年來，濫用抗生素導(dǎo)致耐藥細(xì)菌產(chǎn)生的問題不斷加劇，超級細(xì)菌的出現(xiàn)更使人們重新審視抗生素的定位和作用。越來越多的國家對抗生素在農(nóng)產(chǎn)品中的添加予以限制和禁止，因此，迫切需要開發(fā)能夠取代傳統(tǒng)抗生素的新型添加劑?？咕木哂袩岱€(wěn)定性好、抗菌譜廣、殺菌快、無耐藥性及毒副作用等特點(diǎn)，并且與傳統(tǒng)抗生素共同使用有增效作用，已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。在農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖方面試驗(yàn)結(jié)果顯示，抗菌肽作為飼料添加劑，在肉雞、乳豬和對蝦方面已經(jīng)獲得了很好的成效[5-7]，不僅可以抗病，還可以增強(qiáng)動物機(jī)體的免疫力，提高肉料比，均顯示了抗菌肽具有替代傳統(tǒng)抗生素的潛能。

表2 重組抗菌肽Cecropin AD中試發(fā)酵產(chǎn)物的抗菌譜

隨著抗生素在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中的限制和禁止，必將導(dǎo)致行業(yè)對抗菌肽的需求不斷上漲，但從生物體中提取抗菌肽的含量太少，難度大，而化學(xué)合成成本高等限制因素，已成為抗菌肽開發(fā)應(yīng)用的一個(gè)瓶頸。而通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)抗菌肽則具有成本低廉、產(chǎn)量大的優(yōu)點(diǎn)，有望實(shí)現(xiàn)抗菌肽的規(guī)?；a(chǎn)。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)秀的真核表達(dá)系統(tǒng)，已有多種外源蛋白在酵母表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)并得以應(yīng)用[8-10]。它具有完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制、蛋白質(zhì)加工修飾[11]及分泌能力，而且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素。本研究基于抗菌肽CecropinAD穩(wěn)定性良好的前提，通過畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)組成型表達(dá)抗菌肽Cecropin AD，通過信號肽將其分泌到細(xì)胞外，并進(jìn)行了50 L發(fā)酵罐的中試研究，此方法獲得的抗菌肽作為飼料添加劑，方便快捷，不會因內(nèi)毒素而導(dǎo)致動物機(jī)體中毒和腹瀉，同時(shí)，組成型區(qū)別于甲醇誘導(dǎo)型的酵母表達(dá)方式，培養(yǎng)簡單，無需更換碳源，也可以避免揮發(fā)性的毒性物質(zhì)甲醇污染動物機(jī)體和環(huán)境。

4 結(jié)語

本試驗(yàn)對重組抗菌肽CecropinAD進(jìn)行了50 L規(guī)模的發(fā)酵中試研究，結(jié)果表明，菌體濕重到了后期增長緩慢，其主要原因是抗菌肽在組成型表達(dá)的過程中，隨著Cecropin AD濃度不斷上升，其表現(xiàn)出對酵母宿主菌的毒性作用，當(dāng)表達(dá)的抗菌肽CecropinAD達(dá)到了一定的濃度后，宿主菌停止生長，抗菌肽表達(dá)進(jìn)入平臺期后結(jié)束發(fā)酵。該發(fā)酵周期短，培養(yǎng)簡單方便，節(jié)省成本。后期工作重心在于提高抗菌肽Cecropin AD基因工程菌的生物量及其表達(dá)量，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮源配置，更大程度地降低生產(chǎn)成本，為日后的規(guī)?；a(chǎn)和應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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