陳科全，劉思德，白 楊，張亞歷，彭 亮

1.廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東廣州510120;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科

大腸腺癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國腫瘤死亡率排第五位，近年有明顯上升趨勢(shì)。該病發(fā)生發(fā)展涉及多種基因的改變，這些基因主要包括三類基因:癌基因、抑癌基因和DNA修復(fù)基因。其中，抑癌基因的突變、缺失和沉默失活在大腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。細(xì)胞黏附分子1(cell adhesion molecule 1，CADM1)是Kuramochi等在對(duì)肺癌研究中發(fā)現(xiàn)的，該基因能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制癌細(xì)胞增殖［1］。CADM1已被證實(shí)在人體正常組織中廣泛表達(dá)，但在多種癌組織中表達(dá)減少;且該基因啟動(dòng)子的過甲基化是導(dǎo)致其表達(dá)減少的一個(gè)重要機(jī)制之一［1］。我們研究已發(fā)現(xiàn)CADM1在大腸癌發(fā)病中也發(fā)揮重要作用，啟動(dòng)子的過甲基化也是導(dǎo)致該基因表達(dá)下調(diào)的主要機(jī)制［2］。我們進(jìn)一步探討CADM1表達(dá)下調(diào)與大腸腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本 所有大腸腺瘤及正常腸黏膜、大腸腺癌及癌旁非癌組織標(biāo)本來源于2007年11月～2010年3月在南方醫(yī)院行結(jié)腸鏡切除或外科手術(shù)切除治療的患者，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)確診。大腸腺癌43例，大腸腺瘤20例，男30例，女33例，年齡29～83歲，所有患者術(shù)前均未接受放化療。大腸腺癌中低分化7例、中分化21例、高分化15例;11例未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，32例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移;24例未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，19例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移;9例Dukes’A或B期，34例Dukes’C或D期。組織標(biāo)本分別行兩種方法預(yù)處理:①置入組織保存液(SIGMA公司)，-80℃低溫冰箱保存;② 常規(guī)10%中性甲醛固定。

1.2 RT-PCR 按Trizol［購自天根生化科技(北京)有限公司］說明書步驟抽提組織標(biāo)本總RNA;按RT(逆轉(zhuǎn)錄)試劑盒(購自Fermentas公司)說明書步驟合成cDNA第一鏈;參考文獻(xiàn)［3-4］由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成cDNA第一鏈;并合成引物，CADM1 5'端引物序列(5'-GGTGATGGGCAGAATCTGTTTAC-3')，3'端引物序列(5'-ACCAGGACTGTGATGGTGGTGT-3')，產(chǎn)物為302 bp;GAPDH:5'端引物序列(5'-TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC-3')，3'端引物序列(5'-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC-3')，產(chǎn) 物 為189 bp。選用Premix Ex TaqTM Hot Start Version(購自Takara公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，預(yù)變性95℃ 5 min、變性95℃ 45 s、退火60℃ 1 min、擴(kuò)增72℃ 1 min、反應(yīng)33個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳和半定量分析。

1.3 免疫組化 常規(guī)組織脫水、透明、浸蠟、包埋、制片、脫蠟及組織水化。運(yùn)用 EDTA抗原修復(fù)液進(jìn)行抗原修復(fù);每張組織切片3%過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶活性;山羊血清封閉。加小鼠抗人CADM1單克隆抗體(購自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司，工作液濃度1∶50)，室溫孵育1 h后，置于4℃冰箱過夜;陰性對(duì)照組加PBS替代一抗。加辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG，室溫孵育2 h后，常規(guī)DAB顯色、蘇木素復(fù)染、切片脫水和透明、封片及結(jié)果分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料運(yùn)用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析;計(jì)數(shù)資料運(yùn)用Chi-Square檢驗(yàn)、Fisher’s精確檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大腸腺瘤中CADM1的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示CADM1蛋白在細(xì)胞膜及細(xì)胞漿均有表達(dá)。在20例大腸腺瘤中，CADM1蛋白表達(dá)無缺失或明顯減少。代表組織mRNA表達(dá)灰度比為:正常腺體0.369±0.015，腺瘤0.381±0.034，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);相應(yīng)組織免疫組化結(jié)果如圖1所示。

2.2 大腸腺癌中CADM1的表達(dá) 43例大腸癌組織中，8例CADM1表達(dá)正常，17例表達(dá)減少，18例表達(dá)缺失;所有癌旁非癌組織CADM1均正常表達(dá)。代表組織CADM1 mRNA表達(dá)灰度比如下:代表組織A中非癌組織0.311±0.057，大腸腺癌組織 0.332±0.026，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);代表組織B中非癌組織0.279±0.028，大腸腺癌組織 0.098±0.050，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);代表組織C中檢測(cè)不到CADM1表達(dá)。相應(yīng)組織免疫組化結(jié)果如圖2所示。

2.3 大腸腺癌CADM1表達(dá)下調(diào)與患者臨床特征的關(guān)系 30例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者檢測(cè)到CADM1表達(dá)下調(diào)，5例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者檢測(cè)到CADM1表達(dá)下調(diào)，兩組比較差異顯著(P＜0.05)。Dukes’C期和Dukes’D期患者CADM1表達(dá)下調(diào)頻率顯著高于Dukes’A期和Dukes’B期患者(P＜0.05)。CADM1表達(dá)下調(diào)與性別、T分期、組織分化、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無顯著相關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及Dukes’分期顯著相關(guān)(見表1)。

表1 CADM1表達(dá)下調(diào)與大腸腺癌臨床特征的關(guān)系Tab 1 Correlation between downregulated expression of CADM1 and clinicopathological characteristics of patients with colorectal adenocarcinoma

3 討論

CADM1是一種在非小細(xì)胞肺癌被發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，CADM1可以通過抗增殖及促凋亡活性抑制腫瘤的生長，CADM1功能喪失能導(dǎo)致癌細(xì)胞浸潤及轉(zhuǎn)移［5］。Mao等已證明CADM1胞漿側(cè)的FERM結(jié)合區(qū)和PDZ相互作用亞基是體內(nèi)抑制腫瘤活性的重要區(qū)域［6］。已有研究報(bào)道運(yùn)用RNA干擾技術(shù)抑制正常上皮細(xì)胞CADM1表達(dá)能導(dǎo)致上皮細(xì)胞形態(tài)改變，并使黏附能力下降［7］。因此，CADM1與維持正常上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)的黏附能力有關(guān)。既往我們的研究發(fā)現(xiàn)有部分大腸癌細(xì)胞系CADM1表達(dá)下調(diào)，提示正常大腸上皮細(xì)胞表達(dá)CADM1減少后會(huì)影響正常的黏附功能，導(dǎo)致正常細(xì)胞向癌細(xì)胞特征轉(zhuǎn)變，并獲得浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的惡性細(xì)胞表型。運(yùn)用CADM1重組腺病毒載體增加A549細(xì)胞CADM1表達(dá)能抑制細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，CADM1表達(dá)減少的大腸腺癌細(xì)胞可能具有較強(qiáng)的增殖和抗凋亡行為［5］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)在大腸正常腺體和腺瘤組織CADM1表達(dá)正常，當(dāng)發(fā)生浸潤形成癌時(shí)，CADM1表達(dá)才明顯下調(diào)。以往文獻(xiàn)報(bào)道CADM1 表達(dá)下調(diào)在食管癌［3］、胃癌［8］、胰腺癌［9］、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌［7］及卵巢癌中也被發(fā)現(xiàn)。因此，CADM1在上皮腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。

既往我們的研究發(fā)現(xiàn)在大腸腺癌中CADM1啟動(dòng)子甲基化對(duì)沉默該基因表達(dá)發(fā)揮很關(guān)鍵的作用。這與胰腺癌［9］、胃癌［8］和非小細(xì)胞肺癌［1］的研究結(jié)果一致。但是，Borinstein等報(bào)道在氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)結(jié)腸癌的嚙齒動(dòng)物模型中結(jié)腸癌組織和相鄰正常腸黏膜均無CADM1啟動(dòng)子甲基化［10］。這點(diǎn)不同可能是由于不同物種或?qū)嶒?yàn)引物和/或人和小鼠具有不同大腸癌發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)CADM1表達(dá)下調(diào)在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者更常見，這說明CADM1可能抑制大腸腺癌細(xì)胞的侵襲和浸潤［5］。同時(shí)，研究結(jié)果也顯示CADM1表達(dá)下調(diào)在Dukes’C和D期患者比Dukes’A和B期患者更常見，這也與既往我們研究發(fā)現(xiàn)CADM1啟動(dòng)子過甲基化在晚期患者更常見的結(jié)果一致。因此，隨著大腸癌病情的進(jìn)展，CADM1下調(diào)更明顯，導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力逐漸增強(qiáng)，更加重和加快了病情發(fā)展。類似結(jié)果也在其他腫瘤發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌中pT2期比 pT1期 CADM1下調(diào)明顯［7］;乳腺癌3級(jí)腫瘤較1、2級(jí)腫瘤CADM1下調(diào)明顯;食管鱗狀細(xì)胞癌組織中腫瘤分期惡性程度越高CADM1表達(dá)缺失發(fā)生率越高［3］;肺腺癌中腫瘤浸潤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管和血管浸潤越明顯CADM1表達(dá)越少;這些結(jié)果均表明CADM1表達(dá)狀態(tài)可能是預(yù)測(cè)早期大腸腺癌向進(jìn)展期發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)的有價(jià)值指標(biāo)。盡管如此，我們現(xiàn)在的研究結(jié)果尚不能提供足夠的證據(jù)說明這個(gè)問題。

綜上所述，研究結(jié)果表明CADM1表達(dá)下調(diào)在大腸腺癌中是常見現(xiàn)象，特別是在進(jìn)展期大腸腺癌，因此在人大腸腺癌發(fā)病機(jī)制中該基因發(fā)揮重要作用。通過檢測(cè)高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變的組織標(biāo)本CADM1表達(dá)的狀態(tài)，對(duì)判斷異型細(xì)胞浸潤行為可能有提示意義?；謴?fù)CADM1表達(dá)是否能改變癌細(xì)胞的行為，能否針對(duì)該基因來治療大腸癌將需要對(duì)該基因進(jìn)行深入研究。

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