陳強(qiáng)，王思思，尹躍平，盧紅艷

淋球菌 opa 基因分型方法由 O’Rourke 等[1]于 1995年首先創(chuàng)建，他還對(duì)該分型方法的分辨力、重復(fù)性及其穩(wěn)定性給予了肯定評(píng)價(jià)。此后國(guó)外陸續(xù)有使用 opa 基因分型方法對(duì)淋病奈瑟菌進(jìn)行基因分型的性網(wǎng)絡(luò)研究報(bào)告，如 Fjelds?e-Nielsen等[2]在丹麥、Howie 等[3]在英國(guó)愛丁堡、Khaki 等[4]在印度新德里對(duì)該分型方法均作了研究報(bào)告，并對(duì)其在流行病學(xué)上的應(yīng)用給出了一致的好評(píng)。但國(guó)外有關(guān)此方面的研究都在一個(gè)區(qū)域或城市展開，且樣本量普遍不大，無(wú)論在數(shù)量還是范圍上都難以充分體現(xiàn)該分型方法在流行病學(xué)應(yīng)用上的優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)也尚未見大樣本 opa 分型的報(bào)告。本研究擬在我國(guó)東部和南部的 4 個(gè)城市（南京、濟(jì)南、福州、南寧）收集淋球菌株行 opa 基因分型，分別并綜合分析四地 opa 基因分型結(jié)果，初步探討我國(guó)東部及南部地區(qū) 4 個(gè)城市中 opa 基因型的大致分布狀況，分析不同地區(qū)之間基因分型的關(guān)聯(lián)性，為我國(guó)性網(wǎng)絡(luò)的研究提供一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 淋病患者來(lái)自 4 個(gè)城市，即南京（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所，2006年4月–10月）、濟(jì)南（山東省皮膚病防治所，2006年5月– 2007年2月）、福州（福建省皮膚病防治所，2006年3月– 9月）及南寧（廣西壯族自治區(qū)皮膚病防治所，2006年3月– 2007年2月）。男性標(biāo)本采自尿道分泌物，女性標(biāo)本采自宮頸分泌物，標(biāo)本采集方法根據(jù)現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。采集后的淋球菌在 36℃條件下培養(yǎng) 24～36 h 后經(jīng)轉(zhuǎn)種并分純。所有菌株經(jīng)氧化酶及糖發(fā)酵試驗(yàn)確證為淋病奈瑟菌。經(jīng)確證的菌株洗脫于脫脂牛奶管并置–70℃冰箱中保存。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 CT/NG 核酸提取試劑盒購(gòu)自美國(guó) Roche 公司；Taq DNA 聚合酶、TaqI限制性內(nèi)切酶、HpaII限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自美國(guó) Promega 公司；GeneAmp PCR 9600 擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó) Perkin Elmer 公司；水平電泳儀及電泳槽購(gòu)自北京六一儀器廠；垂直電泳儀及電泳槽、凝膠成像儀均購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；GelCompar II 凝膠分析軟件來(lái)自比利時(shí) Applied Maths 公司。

1.2 方法

1.2.1 淋球菌基因組 DNA 模板制備 按 Roche CT/NG 核酸提取試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，具體操作過(guò)程如下：①將 1/3 環(huán)淋球菌混懸到 400 μl 雙蒸水中；②在 1.5 ml Eppendorf 管中加入 100 μl裂解液；③取 100 μl 混懸的淋菌標(biāo)本至 100 μl 裂解液中，混懸 30 s；④室溫孵育 10min；⑤每管加入 200 μl 稀釋液，混懸 10 s；⑥室溫孵育10min；⑦取 50 μl 進(jìn)行 PCR；⑧多余的儲(chǔ)存于2～8℃，用時(shí)混懸，12500×g 離心 10min。

1.2.2 Opa 基因擴(kuò)增 擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)[5]，上游引物為5’ ATGTGCAGGCGGATTTAGCC 3’；下游引物為5’ AATGAGGCTTCGTGGGTTTTG 3’，引物由上海生工生物工程有限公司合成。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為550 bp。PCR 反應(yīng)體系如下：10×Taq DNA polymerase buffer 10 μl，Taq DNA polymerase 2 U，dNTPs（10mmol/L/each）8 μl；上下游引物各5 μl（50 pmol/L），模板 DNA 20 μl，25mmol/L MgCl26 μl，反應(yīng)體系加滅菌蒸餾水至 100 μl。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94℃2min，然后（94℃20 s，65℃20 s，72℃40 s）×35 循環(huán)，最后末次延伸 72℃10min。PCR 產(chǎn)物檢測(cè)用 1×TBE 制備 1.5%瓊脂糖凝膠，其中含有 1.0 μg/ml EB；將水平電泳儀電壓調(diào)整為100 V，電泳時(shí)間為40min。

1.2.3 限制性酶切 每一份 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物都分別進(jìn)行 TaqI和 HpaII限制性酶切，內(nèi)切酶酶切體系均為20 μl， TaqI酶切體系與 HpaII酶切體系均 65℃過(guò)夜孵育。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳 具體操作方法如下：①制備 10%聚丙烯酰胺凝膠，使之在室溫中聚合 40min，至梳齒下出現(xiàn) Schlieren 線；②取5 μl 樣品，加入 1 μl 6×DNA 上樣緩沖液，混勻后上樣；③電泳槽 150 V 預(yù)熱 10min 后開始電泳，電泳條件為150 V×60min，電泳液為1×TBE；④染色：電泳完畢后將凝膠從電泳槽中取出放于 10%乙醇液中固定 5min，蒸餾水洗數(shù)秒，1%硝酸溶液浸膠 5min，蒸餾水洗數(shù)秒，染色液中染色 10min，蒸餾水沖洗兩次凝膠，置于顯色液中顯色至適當(dāng)顏色，再用 10%冰乙酸終止反應(yīng)并固定凝膠 5min。

1.2.5 圖像處理與聚類分析 將固定后的聚丙烯酰胺凝膠用蒸餾水沖洗后置于凝膠成像系統(tǒng)中采用白光模式拍照，照片以 TIFF 格式輸入到GelComparII 凝膠分析軟件中，按照操作說(shuō)明書進(jìn)行相應(yīng)的聚類分析。

1.2.6 TaqI 酶切結(jié)果的定義方法 淋球菌 opa基因被限制性內(nèi)切酶 TaqI 酶切后所產(chǎn)生的各種不同酶切圖譜的類別被定義為TaqI 型，大部分 TaqI型僅由一株淋球菌組成，部分 TaqI 型通過(guò)聚類分析法后觀察到包括兩株或兩株以上的淋球菌；包含兩株或兩株以上淋球菌的 TaqI 型又稱為TaqI簇。

1.2.7 HpaII 酶切結(jié)果的定義方法 為了進(jìn)一步細(xì)化分型，TaqI 簇可以被 HpaII酶進(jìn)一步分類：①相似性 TaqI 簇定義為一個(gè) TaqI 簇中各 opa基因被限制性內(nèi)切酶 HpaII 消化后它們的酶切條帶圖譜僅有一處條帶的差異；②差異性 TaqI 簇定義為一個(gè) TaqI 簇中各 opa 基因被限制性內(nèi)切酶HpaII 消化后它們的酶切條帶圖譜存在明顯的差異，即存在兩處條帶或以上的差異；③等同性 TaqI簇定義為一個(gè) TaqI 簇中各 opa 基因被限制性內(nèi)切酶 HpaII 消化后它們的酶切條帶圖譜仍保持100%的同一性；④opa 型定義為淋球菌的 opa 基因先后被限制性內(nèi)切酶 TaqI 和 HpaII 消化后具有唯一性的酶切條帶圖譜；⑤opa 簇定義為一組淋球菌的 opa 基因先后被限制性內(nèi)切酶 TaqI 和HpaII 消化后它們的酶切條帶圖譜分別能達(dá)到100%的同一性。

2 結(jié)果

2.1 菌株收集情況與 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

4 個(gè)城市中，共有 468 名患者被確診為淋病，其中南京 117 例、濟(jì)南 103 例、福州 147 例、南寧 101 例。在這 468 例淋病患者中，其中有 36例患者未獲得陽(yáng)性培養(yǎng)結(jié)果，102 例在 –70℃保藏后未能復(fù)蘇。4 個(gè)城市中實(shí)際做分型的菌株分別為：南京 86 例、濟(jì)南 80 例、福州 94 例、南寧70 例，共計(jì) 330 例。其中來(lái)自南京的菌株用 NJ表示；來(lái)自濟(jì)南的菌株用 JN 表示；來(lái)自福州的菌株用 FZ 表示；來(lái)自南寧的菌株用 NN 表示。

2.2 TaqI 酶切及其聚類分析

南京 86株淋球菌 opa 基因經(jīng) TaqI 酶切后的聚類分析產(chǎn)生 77 個(gè) TaqI 型，其中 68個(gè) TaqI型各由一株菌組成，9 個(gè) TaqI 型各由 2株菌組成。濟(jì)南 80株淋球菌 opa 基因經(jīng) TaqI 酶切后的聚類分析產(chǎn)生 68 個(gè) TaqI 型，其中 58 個(gè) TaqI型各由一株菌組成，10 個(gè) TaqI 型由 2株或 2株以上的菌株組成。福州 94株淋球菌 opa 基因經(jīng)TaqI 酶切后產(chǎn)生 83 個(gè) TaqI 型，其中 74 個(gè)TaqI 型各由一株菌組成，9 個(gè) TaqI 型由 2株或2株以上的菌株組成。南寧 70株淋球菌 opa 基因經(jīng) TaqI 酶切后的聚類分析產(chǎn)生 63 個(gè)TaqI 型，其中 58 個(gè) TaqI 型各由一株菌組成，5 個(gè) TaqI型由 2株或 2株以上的菌株組成。以上 4 個(gè)城市共 330株淋球菌的聚類分析顯示：330株淋球菌共產(chǎn)生了 275 個(gè)互不相同的 TaqI 型，其中231 個(gè) TaqI 型各由一株淋球菌組成，余下的99株淋球菌分屬于 44 個(gè) TaqI 型（簇），包括35 組對(duì)子，7 組各含有 3株淋球菌，2 組各含有4株淋球菌。

2.3 HpaII 酶切及其聚類分析

對(duì)以上分屬于 44 個(gè) TaqI 簇的 99株淋球菌opa 基因進(jìn)行限制性內(nèi)切酶 HpaII 消化。在這44 個(gè) TaqI 簇中，其中 15 個(gè) TaqI 簇每組所包括的淋球菌來(lái)自兩個(gè)或以上的城市。這 15 個(gè) TaqI簇所包括淋球菌的 opa 基因在進(jìn)一步接受限制性內(nèi)切酶 HpaII 消化后沒(méi)有等同性 TaqI 簇出現(xiàn)，產(chǎn)生了 2 個(gè)相似性 TaqI 簇和 13 個(gè)差異性 TaqI簇。因此，在 15 個(gè) TaqI 簇中，通過(guò) TaqI 和HpaII 兩種限制性內(nèi)切酶的分別消化共產(chǎn)生了34 個(gè) opa 型。在 44 個(gè) TaqI 簇中有 29 個(gè) TaqI簇每組所包括的淋球菌來(lái)自同一城市。這 29 個(gè)TaqI 簇所包括淋球菌的 opa 基因在進(jìn)一步接受限制性內(nèi)切酶 HpaII 消化后共產(chǎn)生 14 個(gè)等同性TaqI 簇，7 個(gè)相似性 TaqI 簇和 8 個(gè)差異性 TaqI簇。因此在 29 個(gè) TaqI 簇中，通過(guò) TaqI 和 HpaII兩種限制性內(nèi)切酶的分別消化共產(chǎn)生了 44 個(gè)opa 型（表1）。

表1 330株淋球菌 TaqI 和 HpaII 限制性酶切后的 opa 基因分型結(jié)果Table 1 Opa typing of 330 isolates of N.gonorrhoeas with TaqI and HpaII

2.4 TaqI 與 HpaII 酶切結(jié)果分析

對(duì)所有調(diào)查的 330株淋球菌先后采用限制性內(nèi)切酶 TaqI 和 HpaII 進(jìn)行 opa 基因分型后共產(chǎn)生了 309 個(gè) opa 型，其中有 292 個(gè) opa 型各包含一株淋球菌，14 個(gè) opa 型各包含 2株淋球菌，2 個(gè) opa 型各包含 3株淋球菌，還有一個(gè) opa 型包含 4株淋球菌（表1）。在 292株各代表一個(gè)opa 型的淋球菌中，通過(guò)聚類分析所生成的樹狀圖我們還發(fā)現(xiàn)有 18株淋球菌形成 9 個(gè)相似對(duì)子。在研究對(duì)象的四個(gè)城市中，包含一株菌的 opa 型占各城市所有 opa 型數(shù)量的比例分別為：南京90.7%，濟(jì)南 77.5%，福州 89.4%，南寧 97.1%。

圖1 分屬于 44 個(gè) TaqI 簇的 99株淋球菌 opa 基因 HpaⅡ 酶切圖譜聚類分析Figure 1 Master dendrogram of relationships between 44 TaqI clusters of 99 isolates of Neisseria gonorrhoeae as calculated by the Dice coefficient

2.5 Opa 簇

TaqI 和 HpaII 兩種限制性內(nèi)切酶共確定26 個(gè)包括兩株或以上菌株的組，其中包括 17 個(gè)opa 簇（菌株間 opa 基因的相似性為100%，14 個(gè)opa 簇各包含兩株菌，2 個(gè) opa 簇各包含三株菌及一個(gè)包含四株菌的 opa 簇）和 9 個(gè) opa 型相似對(duì)（菌株間 opa 基因的相似性在 90%～100%之間）（圖1）。而患者的流行病學(xué)資料顯示在 19 名淋病患者中存在 9 組已知的性接觸（包括 8 對(duì)及1 個(gè)三人組）。其中 8 個(gè)已知的性接觸信息由8 個(gè) opa 簇所確證，剩下的一個(gè)性接觸信息也被一個(gè) opa 型相似對(duì)所印證。

3 討論

在淋病的流行病學(xué)調(diào)查研究中，opa 分型是一種分辨力很高的基因分型方法，這種方法也被認(rèn)為是一種能指定患者之間存在性聯(lián)系的可靠指針[1, 6-7]。

研究發(fā)現(xiàn)在使用第一種限制性內(nèi)切酶 TaqI 后330株淋球菌共產(chǎn)生了 44 個(gè) TaqI 簇，其中15 個(gè) TaqI 簇各自包含的淋球菌來(lái)自兩個(gè)或以上的城市，余下 29 個(gè) TaqI 簇各自包含的淋球菌來(lái)自同一個(gè)城市。用第二種限制性內(nèi)切酶 HpaII 對(duì)這44 個(gè) TaqI 簇做進(jìn)一步的酶切聚類分析，有趣的是我們發(fā)現(xiàn)在這 15 個(gè)不同城市菌株來(lái)源的 TaqI 簇中沒(méi)有產(chǎn)生等同性 TaqI 簇，而 29 個(gè)相同城市菌株來(lái)源的 TaqI 簇產(chǎn)生了 14 個(gè)等同性 TaqI 簇，占 48%。同樣，15 個(gè)不同城市菌株來(lái)源的 TaqI 簇僅產(chǎn)生了 2 個(gè)相似性 TaqI 簇，而 29 個(gè)相同城市菌株來(lái)源的 TaqI 簇產(chǎn)生了 7 個(gè)相似性 TaqI 簇。由此可見不同城市菌株來(lái)源的 TaqI 簇比相同城市菌株來(lái)源的 TaqI 簇更容易被第二種限制性內(nèi)切酶HpaII 所分解，這表明相同城市來(lái)源的菌株在基因水平上比不同城市來(lái)源的菌株更具有相似性，這也在一定程度上表明各不同城市淋球菌 opa 基因具有它們各自的特征，相互之間保持相對(duì)的獨(dú)立性。

從另一個(gè)層次上說(shuō)，opa 基因分型方法用兩種限制性內(nèi)切酶共確定 26 個(gè)包括兩株或以上菌株的組，其中包括 17 個(gè) opa 簇和 9 個(gè) opa 型相似對(duì)。這 26 個(gè)組中的絕大多數(shù)（17 個(gè) opa 簇和7 個(gè) opa 型相似對(duì)）其各組中所包含的淋球菌均來(lái)自同一個(gè)城市。我們未發(fā)現(xiàn)任何等同性 TaqI 簇包含的淋球菌來(lái)自兩個(gè)或以上的城市，也僅有2 個(gè)相似性 TaqI 簇包含的淋球菌來(lái)自兩個(gè)不同的城市。和我們的研究相比而言，英國(guó) Palmer 等[8]所做的 opa 基因分型研究顯示：屬于某一共同 opa型的淋球菌可以分布在英格蘭及南威爾士的各個(gè)城市中。而我們的研究結(jié)果表明在基因水平上來(lái)自同一城市的淋球菌比來(lái)自不同城市的淋球菌具有更大的相似性，而且每個(gè)城市都具有其獨(dú)特的 opa型，各個(gè)城市在 opa 型的分布上具有相對(duì)的獨(dú)立性。

研究中我們還發(fā)現(xiàn)患者所提供的性接觸信息和我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間具有較高的一致性。Opa 分型確證了所有由患者提供的性接觸信息，顯示了opa 分型方法的分型能力及其在確證患者性聯(lián)系方面的正確性。除此之外 opa 分型發(fā)現(xiàn)的 opa 簇要比患者性接觸信息反映的性關(guān)系數(shù)量更多。這也說(shuō)明 opa 基因分型方法在揭示患者性接觸方面所能反映的信息比患者愿意提供的性接觸信息更豐富。兩者之間存在差異的原因在文獻(xiàn)[9]中也有所報(bào)道，這包括 opa 基因隨著時(shí)間的推進(jìn)而發(fā)生自然演化以及可能存在的混合感染，混合感染意味著一位淋病患者同時(shí)攜帶兩種不同 opa 型的淋球菌。但根據(jù)我們研究提供的菌株收集資料來(lái)看，所有存在性聯(lián)系的菌株它們?cè)跇?biāo)本采集時(shí)間上的間隔都是很短的，除了一對(duì)菌株收集的時(shí)間間隔為9 d，另一對(duì)大概在 1 個(gè)月左右外，其余大多數(shù)間隔時(shí)間都在 2 d 以內(nèi)。O'Rourke 等在他們的研究中還發(fā)現(xiàn)用限制性內(nèi)切酶 TaqI 給連續(xù)十次傳代淋球菌的 opa 基因分別進(jìn)行酶切消化，發(fā)現(xiàn)它們的酶切圖譜還能保持一致，這說(shuō)明在一定程度上 opa分型具有相對(duì)的穩(wěn)定性。從 O'Rourke 等[1]的研究中可以推算，在較短的時(shí)間跨度之內(nèi)我們研究中的opa 基因不可能發(fā)生明顯的演化。而混合感染在我們研究的菌株間也不可能發(fā)生，因?yàn)槌艘恢炅芮蚓馄渌蟹蛛x株攜帶者在此前一年時(shí)間內(nèi)都沒(méi)有過(guò)診斷淋病的記錄。導(dǎo)致這種差異更為真實(shí)的原因可能是患者提供的性接觸信息不完整，也就是說(shuō)一些淋病患者不愿透漏自己與其他淋病患者之間存在某種程度上的性聯(lián)系，這就是為什么一些實(shí)驗(yàn)室結(jié)果反映的信息量要比患者提供信息量大的原因。另一種可能解釋就是實(shí)驗(yàn)室確立的性聯(lián)系淋球菌菌株來(lái)自于一個(gè)有性聯(lián)系的集團(tuán)，集團(tuán)中各菌株分屬于相同或相似的 opa 型，菌株攜帶者之間可能沒(méi)有直接的性接觸，但他們卻共處于一條性傳播鏈上。

總而言之，本研究對(duì) 330株淋病奈瑟菌進(jìn)行opa 分型使我們獲得了比患者提供的性接觸資料更為豐富的信息。然而在整個(gè)研究當(dāng)中我們并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)較大規(guī)模的 opa 簇。Opa 分型方法能提供給研究者一些性接觸信息，這些信息淋病患者自身并不愿提供給他人。正是 opa 基因分型方法所具有的這種能力幫助我們更好地了解淋球菌的傳播路徑、為淋球菌傳播的控制提供預(yù)防、控制和追蹤措施。

[1]O'Rourke M, Ison CA, Renton AM, et al.Opa-typing: a high-resolution tool for studying the epidemiology of gonorrhoea.Mol Microbiol, 1995, 17(5):865-875.

[2]Fjelds?e-Nielsen H, Unemo M, Fredlund H, et al.Phenotypic and genotypic characterization of prolyliminopeptidase-negative Neisseria gonorrhoeae in Denmark.Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2005,24(4):280-283.

[3]Howie F, Young H, McMillan A.The diversity of the opa gene in gonococcal isolates from men who have sex with men.Sex Transm Infect, 2004, 80(4):286-288.

[4]Khaki P, Bhalla P, Fayaz AM, et al.Molecular typing of neisseria gonorrhoeae isolates by opa-typing and ribotyping in New Delhi,India.Int J Microbiol, 2009, 2009:934823.

[5]Viscidi RP, Demma JC, Gu J, et al.Comparison of sequencing of the por gene and typing of the opa gene for discrimination of Neisseria gonorrhoeae strains from sexual contacts.J Clin Microbiol, 2000,38(12):4430-4438.

[6]Bilek N, Martin IM, Bell G, et al.Concordance between Neisseria gonorrhoeae genotypes recovered from known sexual contacts.J Clin Microbiol, 2007, 45(11):3564-3567.

[7]Morris AK, Palmer HM, Young H.Opa-typing can identify epidemiologically distinct subgroups within Neisseria gonorrhoeae multi-antigen sequence type (NG-MAST) clusters.Epidemiol Infect,2008, 136(3):417-420.

[8]Palmer HM, Leeming JP, Turner A.Investigation of an outbreak of ciprofloxacin-resistant Neisseria gonorrhoeae using a simplified opa-typing method.Epidemiol Infect, 2001, 126(2):219-224.

[9]Ward H, Ison CA, Day SE, et al.A prospective social and molecular investigation of gonococcal transmission.Lancet, 2000, 356(9244):1812-1817.