劉堂義,楊華元,蒯樂,高明,楊旭明

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穴位電刺激對大鼠急性運動后腓腸肌收縮功能的影響

劉堂義,楊華元,蒯樂,高明,楊旭明

(上海中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院中醫(yī)工程研究室,上海 201203)

探討穴位電刺激療法對大鼠急性運動后腓腸肌收縮功能的影響。45只SD大鼠,隨機分成三組,適應(yīng)性游泳訓(xùn)練1星期后,進行急性運動(2 h的游泳),全麻下取腓腸肌,應(yīng)用差速離心法提取SR,檢測肌質(zhì)網(wǎng)(SR)鈣泵(Ca2＋-ATPase)、Ca2＋濃度;30只SD大鼠,隨機分成正常對照組、急性運動模型組、穴位電刺激治療組三組,運動后制備坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本,在SMUP-E型生物信息處理系統(tǒng)上觀察腓腸肌最大收縮力。模型組大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase的活力明顯低于對照組(＜0.05),治療組則明顯高于模型組(＜0.05);模型組大鼠腓腸肌SR Ca2＋濃度明顯高于對照組(＜0.05),治療組則明顯低于模型組(＜0.01),治療組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05);模型組大鼠腓腸肌的最大收縮力明顯小于對照組(＜0.05),而治療組則明顯大于模型組(＜0.05)。一次性急性游泳(2 h)大鼠腓腸肌SR的Ca2＋-ATPase活性明顯下降,Ca2＋濃度顯著升高,腓腸肌的最大收縮力下降;穴位電刺激則可以明顯提高大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase的活力,降低SR內(nèi)Ca2＋濃度,增強大鼠腓腸肌的最大收縮力。這可能是穴位電刺激療法延緩運動疲勞的機理之一。

電針療法;肌質(zhì)網(wǎng);Ca2＋轉(zhuǎn)運ATP酶;鈣離子;最大收縮力;穴,足三里;穴,承山

既往的試驗觀察發(fā)現(xiàn),穴位電刺激方法可以有效地提高運動員快速力量[1-3]。骨骼肌SR的Ca2＋-ATPase (鈣泵)在骨骼肌運動過程中起著重要的作用,是骨骼肌興奮收縮耦聯(lián)的關(guān)鍵步驟,它直接影響到運動員競技過程中的快速力量及運動性疲勞的產(chǎn)生,而骨骼肌收縮功能則直接反映骨骼肌的快速力量及疲勞的程度。本項目通過觀察穴位電刺激方法對急性運動后大鼠骨骼肌收縮能力及肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋-ATPase功能、Ca2＋濃度的影響,探討穴位電刺激延緩運動性疲勞的作用機理,為進一步完善穴位電刺激方法及研制專門的穴位電刺激儀器提供實驗依據(jù),既是前期研究工作的延續(xù),也為深入的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

1.1.1 大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase的檢測

50只SD雄性大鼠,由上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供[實驗動物使用許可證號為SYXK(滬)2004- 0005],常規(guī)飼養(yǎng),動物實驗過程完全遵照國家科技部“實驗動物護理和使用指南”[4]。分組前進行適應(yīng)性訓(xùn)練1星期,第1天20 min,以后每天增加10 min,第6、7天均為1 h,剔除不適合游泳者,選取45只大鼠。常規(guī)飼養(yǎng)。第8天將45只大鼠隨機分成三組(對照組、模型組、治療組),每組15只大鼠,對照組不固定、不游泳,模型組在鼠架上固定20 min,休息10 min,置水槽中游泳[水槽高1.4 m,水深1 m,水溫(30±2)℃],時間為2 h,游泳期間密切觀察大鼠游泳狀況,如發(fā)現(xiàn)沉底超過5 s者,即撈出讓其休息3 min,再游泳,直至2 h。治療組大鼠固定于鼠架上,進行穴位電刺激,時間為20 min,治療結(jié)束后休息10 min,再進行游泳,游泳方法同模型組。游泳結(jié)束后進行實驗。

三組大鼠均于腹腔注射20g/L戊巴比妥鈉(1.2 mL /kg)麻醉,取左下肢腓腸肌(完整肌群,具體方法見下文),洗凈備檢。

1.1.2 大鼠腓腸肌最大收縮力的檢測

35只SD大鼠經(jīng)過游泳訓(xùn)練選取30只大鼠,分組及游泳處理方法同第一次實驗。游泳結(jié)束后,大鼠進行肌力測試(操作方法見本文1.3.4)。

1.2 選穴

雙側(cè)足三里、承山。選穴方法參見五版統(tǒng)編教材《實驗針灸學(xué)》。

1.3 實驗方法

SMUP-E型生物信息處理系統(tǒng)由復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系生產(chǎn);G6805-2型電針儀由上海市醫(yī)療器械高技術(shù)公司生產(chǎn);Ca2＋試劑盒由南京建成生物有限公司生產(chǎn);Ca2＋-ATPase試劑盒由南京建成生物有限公司生產(chǎn)。

1.3.1 肌質(zhì)網(wǎng)(SR)囊泡的制備

參照Carl法[5],將骨骼肌標本用預(yù)冷的標準Hank's液沖洗3次,置預(yù)冷的5倍體積(重量比容量) SR提取緩沖液中。SR緩沖液為蔗糖0.25 mol/L,Tris- HCl 10 mmol/L,pH 7,EDTA-Na20.1 mmol/L。骨骼肌先剪碎,高速勻漿30 s,2次,期間間膈30 s,組織勻漿經(jīng)四層紗布過濾,離心1000×,20 min,保留上清液,沉淀物再加5倍體積SR提取緩沖液,重復(fù)前述勻漿離心過程,收集混合兩次上清液,棄沉淀物。再離心40000×,90 min,棄上清,沉淀用0.6 mol/L KCl混懸冰上靜置15 min,再離心40000×,90 min,最后沉淀的SR用不含EDTA的上述SR提取緩沖液混懸?？捡R斯亮蘭法進行蛋白定量,調(diào)蛋白濃度至2 g/L,液氮速凍后置－70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋-ATPase活力的測定

參照南京建成Ca2＋-ATPase試劑盒所附的方法測定Ca2＋-ATPase活力,其計算方法為每小時每毫克蛋白分解ATP產(chǎn)生1mmol無機磷的量為一個ATP酶活力單位,即mmolPi/mgprot/hour。

1.3.3 骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度測定

參照南京建成Ca2＋試劑盒所附的方法測定Ca2＋-ATPase活力。應(yīng)用比色法測定肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度,單位為mmol/gprot。

1.3.4 坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本的制備

實驗動物麻醉后,俯臥位固定于手術(shù)板上,剃去大鼠后肢及軀干后背部的毛,沿著后肢內(nèi)側(cè)自踝部向上至大腿根部上方3 cm處剪開皮膚,小心剝離,暴露肌層,沿踝部正中線長軸向上縱行切開股二頭肌,待其向兩側(cè)分離,確認中間有下腓腸肌后,分離腓腸肌至跟腱處,通過張力換能器與SM-MUL生理記錄儀相連,然后剪斷跟腱端,膝關(guān)節(jié)端固定于定位儀上。另由左側(cè)梨狀溝處分離出坐骨神經(jīng),將SM-MUL生理記錄儀的刺激電極與之相連。至此制成小鼠在體的坐骨神經(jīng)-腓腸肌標本。

1.3.5 大鼠腓腸肌收縮能力測試

用方波單刺激坐骨神經(jīng),方波電壓4 V,間隔時間0.4 ms,刺激20次,取最大值。

2 實驗結(jié)果

2.1 大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase及肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度的檢測結(jié)果

表1顯示,模型組大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase的活力明顯低于對照組(＜0.05),治療組則明顯高于模型組(＜0.05);而模型組肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2＋濃度明顯高于對照組(＜0.05),治療組則明顯低于模型組(＜0.01);治療組大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase的活力、肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度與對照組比無顯著性差異(＞0.05)。結(jié)果提示,一次性急性游泳(2 h)可以使大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase明顯下降,肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度則明顯升高,而穴位電刺激則可以明顯提高大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase的活力,降低肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度,基本恢復(fù)到運動前水平。

表1 三組實驗大鼠腓腸肌SR Ca2＋-ATPase及肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度檢測結(jié)果 (±s)

注:與模型組比較1)＜0.05,2)＜0.01

2.2 大鼠腓腸肌最大收縮力的檢測結(jié)果

表2顯示,模型組大鼠腓腸肌的最大收縮力明顯小于對照組(＜0.05),而治療組則明顯大于模型組(＜0.05)。實驗結(jié)果提示,一次性急性游泳(2 h)可以明顯減小大鼠腓腸肌的最大收縮力,而通過穴位電刺激則可以明顯提高大鼠腓腸肌的最大收縮力。

表2 三組實驗大鼠腓腸肌最大收縮力的檢測結(jié)果(±s)

注:與模型組比較1)＜0.05

3 討論

國內(nèi)90年代開始有科研人員探討針刺對胞質(zhì)Ca2＋及肌質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)Ca2＋功能的影響。如動物實驗發(fā)現(xiàn)超負荷運動可導(dǎo)致肌細胞超微結(jié)構(gòu)改變,細胞內(nèi)Ca2＋活度升高,骨骼肌膜電位的絕對值均顯著降低,而針刺治療能夠改善細胞內(nèi)Ca2＋的代謝,從而促進超微結(jié)構(gòu)損傷的修復(fù)[6]。針刺還可以使超負荷運動所致增高的骨骼肌細胞內(nèi)Ca2＋活度值迅速降低,肌細胞膜電位得到迅速恢復(fù)[7]。有人利用電刺激誘發(fā)爪蟾腓腸肌結(jié)構(gòu)損傷模型及電子探針微區(qū)分析技術(shù)測定細胞內(nèi)Ca2＋、Na＋、Mg2＋、Cl－濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)針刺在體或離體的損傷肌肉均能使肌纖維胞質(zhì)內(nèi)增加的Ca2＋濃度迅速降至對照組水平。與此同時,肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋含量無明顯改變,而胞質(zhì)Na＋則進一步上升,不僅高于對照組,也高于在體未針刺肌,利用熒光指示劑Fura-2測定離體青蛙半腱肌胞質(zhì)自由Ca2＋濃度,發(fā)現(xiàn)針刺使正常肌Ca2＋上升,而使長時間電刺激至力竭疲勞肌肉細胞內(nèi)Ca2＋下降[8]。

本次實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),一次性急性運動導(dǎo)致了大鼠骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2＋水平顯著升高,而SR Ca2＋-ATPase (鈣泵)的活力明顯下降,腓腸肌收縮能力下降。造成這種結(jié)果的原因可能是由于運動過程中為適應(yīng)骨骼肌收縮的需要,鈣泵不斷攝取Ca2＋,但隨著運動時間的延長,可能受多種途徑原因的影響,鈣泵釋放Ca2＋的能力下降,導(dǎo)致Ca2＋在肌質(zhì)網(wǎng)堆積,反過來影響鈣泵的活性,最終影響鈣泵攝取和釋放Ca2＋的能力,抑制了骨骼肌興奮-收縮耦聯(lián),引起骨骼肌收縮功能下降。根據(jù)近年來有關(guān)于肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣泵功能與骨骼肌收縮能力關(guān)系的研究結(jié)果,我們分析造成這種結(jié)果的原因可能有以下幾點。第一,骨肌質(zhì)內(nèi)Ca2＋的水平與鈣泵的活性有關(guān)。鈣泵的活性受多種生化因素的調(diào)節(jié),而且多數(shù)是因為鈣泵攝取和釋放Ca2＋、水解ATP的循環(huán)途徑中某個狀態(tài)受到影響所導(dǎo)致。如SR膜上的磷脂酞乙醇的含量變化可直接影響鈣泵活性和Ca2＋攝取能力[9,10],膜流動性的改變通過影響SR鈣泵的構(gòu)象而改變其活性[11,12],當攝入到SR內(nèi)側(cè)的Ca2＋達到一定濃度時與磷脂酞膽堿發(fā)生作用,通過影響膜的流動性、調(diào)節(jié)鈣泵的構(gòu)象而抑制鈣泵的活性[13],因此攝取到SR內(nèi)側(cè)的Ca2＋對鈣泵活性起反向抑制作用,這也說明肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2＋水平可能反過來影響鈣泵的功能。第二,多種原因影響Ca2＋釋放通道(RyR1受體)的活性。急性運動導(dǎo)致的肌肉疲勞、缺氧等病理狀態(tài)可能起著調(diào)控RyR1受體功能作用,這些原因?qū)е铝薘yR1受體活性下降,影響肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2＋的釋放,導(dǎo)致Ca2＋的堆積[14]。第三,急性運動導(dǎo)致SR數(shù)目減少(包括囊泡腔內(nèi)Ca2＋結(jié)合區(qū)域和空間減少)及Ca2＋-ATPase降解和合成的速率增加有關(guān),有研究表明蛋白周轉(zhuǎn)的速率可能影響肌肉收縮活動的適應(yīng)能力和重塑能力[15]。第四,穴位電刺激方法影響鈣泵的活性可能與細胞內(nèi)能量代謝、自由基代謝等改變有關(guān)。有研究表明,穴位電刺激方法可以顯著性提高疲勞大鼠骨骼肌ATPase、LDH和CPK活性[16],糾正自由基代謝,減少代謝產(chǎn)物的堆積[17]。第五,骨骼肌肌力的增強還有可能與神經(jīng)因素有關(guān)。運動性疲勞的產(chǎn)生可能與運動神經(jīng)的興奮性改變(如神經(jīng)沖動發(fā)放的頻率減少或衰減)、神經(jīng)肌肉接點處的棘突動作電位的改變、興奮和抑制興氨基酸的分泌等因素有關(guān)[18],有研究表明經(jīng)皮電刺激方法可以有效促進周圍神經(jīng)再生,改善受損的神經(jīng)支配的肢體功能[19]。

為適應(yīng)現(xiàn)代競技體育的需求,針灸與體育科研人員進行了密切的合作,將傳統(tǒng)的針灸療法與電刺激方法相結(jié)合,形成了穴位電刺激方法,進行了提高運動員快速力量及延緩運動性疲勞方面的研究,取得了一定的科研成果[10]。本次實驗主要探討了穴位電刺激方法對急性運動大鼠骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度及Ca2＋-ATPase活力的影響,提示穴位電刺激可能通過影響肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋循環(huán),達到延緩急性運動性疲勞的目的。進一步的研究可以繼續(xù)探討穴位電刺激方法對鈣泵形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能等的影響,以及對Ca2＋轉(zhuǎn)運功能的影響,有助于揭示穴位電刺激方法延緩運動性疲勞的機制。

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Effect of Acupoint Electrostimulation on Gastrocnemius Contractility in Rats after Acute Exercise

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,-,201203,

To explore the effect of acupoint electrostimulation on gastrocnemius contractility in rats after acute exercise.Forty-five SD rats were randomly allocated to three groups. Acute exercise (2 hr swimming) was done after adaptive swimming training. The gastrocnemius was taken under general anesthesia. The sarcoplasmic reticulum (SR) was extracted by differential centrifugation. SR calcium pump (Ca2＋-ATPase) and Ca2＋concentration were measured. The 30 SD rats were randomly allocated to three groups: normal control, model of acute exercise and acupoint electrostimulation treatment. A specimen of sciatic nerve–gastrocnemius was made after the exercise. The maximum gastrocnemius contractility was determined using a SMUP-E bioinformation process system.Gastrocnemius SR Ca2＋-ATPase activity was significantly lower in the model group of rats than in the control group (＜0.05) and was significantly higher in the treatment group than in the model group (＜0.05). Gastrocnemius SR Ca2＋concentration was significantly higher in the model group of rats than in the control group (＜0.05) and was significantly lower in the treatment group than in the model (＜0.01). There were no statistically significant differences between the treatment and control groups (＞0.05). The maximum gastrocnemius contractility was significantly lower in the model group of rats than in the control (＜0.05) and was significantly higher in the treatment group than in the model group (＜0.05).Gastrocnemius SR Ca2＋-ATPase activity decreases significantly, Ca2＋concentration increases significantly and the maximum gastrocnemius contractility decreases in rats after an acute swim (2 hrs). Acupoint electrostimulation can significantly increase gastrocnemius SR Ca2＋-ATPase activity, decrease SR Ca2＋concentration and strengthen maximum gastrocnemius contractility in rats. This may be one of the mechanisms by which acupoint electrostimulation therapy delays sports fatigue.

Electroacupuncture; Sarcoplasmic reticulum; Ca2＋-ATPase; Calcium ion; Maximum contractility; Acupoint, ST 36; Acupoint, BL 57

R2-03

A

10.3969/j.issn.1005-0957.2011.10.707

1005-0957(2011)10-0707-04

上海高校優(yōu)秀青年教師后備人選科研項目(04YQHB130)

劉堂義(1969 - ),男,副教授,博士

2010-12-27