熊建華，盛小偉、，高永華、，李文蘭，楊彥豪，陳曉漢

(1.廣西水產(chǎn)研究所遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西南寧530021;2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西桂林541000)

Sec61γ基因編碼是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運通道蛋白Sec61的一種亞基［1］。在真核生物中，Sec61是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的跨膜復(fù)合體，是轉(zhuǎn)運功能蛋白的運輸通道［2］，其主要功能是形成一個疏水通道。在新生肽鏈的共翻譯轉(zhuǎn)運過程中，由于新生肽鏈的N端帶有正電荷，不能輕易易位進入疏水的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，要完成蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運，必然要形成一個蛋白引導(dǎo)通道，讓核糖體合成的新生多肽通過并穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔［3－4］。通道的形成涉及Sec61復(fù)合體與核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白三者的相互作用［5］。目前，關(guān)于Sec61通道主要基因的研究主要集中在微生物［6］、果蠅［7］和哺乳動物［8］。對于 Sec61γ 基因的認識僅限于其作為Sec61通道一個亞基，其單獨的功能研究鮮見報道。本研究中，作者在構(gòu)建的凡納濱對蝦Litopenaeus vannamei生長性狀差減cDNA文庫中篩選并克隆得到凡納濱對蝦Sec61γ基因氨基酸序列，研究了其在不同組織和不同生長期肌肉中的表達模式，旨在為進一步弄清該基因復(fù)合物的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及在凡納濱對蝦生長和發(fā)育中的作用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用凡納濱對蝦取自國家級廣西水產(chǎn)研究所南美白對蝦良種場。選擇一個生長性狀分離的對蝦家系，在水族箱中暫養(yǎng)7 d，充氣，使其適應(yīng)實驗室內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境。實驗用海水是用鹽鹵配制的，鹽度為28，水溫為28℃。

實驗所用Taq DNA聚合酶購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;SYBR Green Master熒光定量PCR試劑盒、PCR－SelectTMcDNA Subtraction kit購自大連寶生物工程有限公司;擴增試劑盒購自Clontech公司;M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司;pMD18－T克隆載體、dNTP購自北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 差減文庫的構(gòu)建 兩組凡納濱對蝦平均體質(zhì)量分別為18.24 g和10.33 g，日齡為93 d。每組取10尾蝦，每尾對蝦取30 mg肌肉組織，組內(nèi)混合后分別提取RNA。按照Invitrogen公司的Trizol使用說明書提取并純化其總RNA。差減文庫構(gòu)建的具體操作依照clontech差減雜交試劑盒PCR－SelectTMcDNA Subtraction kit的方法進行。以較大一組對蝦樣品 (18.24 g)作為差減雜交的試驗方(Tester)，以較小一組的對蝦樣品 (10.33 g)作為驅(qū)動方 (Driver)。試驗步驟簡述如下:將RNA依次合成cDNA第1鏈與雙鏈cDNA，純化后經(jīng)Rsa I酶切消化成平末端cDNA片段，將試驗方連接接頭后與驅(qū)動方進行兩輪雜交，然后進行抑制性PCR，第二輪PCR采用的是套式PCR引物 (Nested primer 1 和Nested primer 2R)。SSH產(chǎn)物按qiagen pcr純化試劑盒的方法純化，產(chǎn)物經(jīng)濃縮后溶于25 μL 10 mmol/L Tris·HCl中。采用T/A克隆方法，取純化的PCR產(chǎn)物3 μL，按 Promega pGEM－T Easy Vector Systems的方法與載體pGEM－T連接，形成抑制差減雜交質(zhì)粒文庫。取1 μL連接物與40 μL感受態(tài)細胞DH10B混合，電轉(zhuǎn)化后加入1 mL SOC培養(yǎng)液置于37℃培養(yǎng)箱中，慢速搖l h。取100 μL菌液涂于含50 μg/mL Amp的LB/X－gal/IPTG培養(yǎng)板上，37℃下培養(yǎng)14 h。統(tǒng)計培養(yǎng)板上的藍白菌落數(shù)，計算滴度。挑取白斑克隆，點種于盛有LB液體培養(yǎng)基的384孔克隆板中，培養(yǎng)過夜，加入質(zhì)量分數(shù)為25%甘油后于液氮中速凍，－80℃下保存。

1.2.2 斑點雜交與測序 從差減文庫中挑選陽性克隆，經(jīng)細菌培養(yǎng)和抽提質(zhì)粒后，利用接頭序列引物進行PCR擴增，將產(chǎn)物點膜，分別與標記的Tester和Driver cDNA作探針進行斑點雜交。42℃下先預(yù)雜交 1 h，然后雜交 18 h，洗膜，用CYCLONE掃描儀掃描圖像，信號定量并分析試驗結(jié)果。只與Tester cDNA有雜交信號而與 Driver cDNA無雜交的克隆，為含Tester組特異表達;與Tester cDNA雜交信號比與Driver cDNA雜交信號強的克隆，為上調(diào)表達的基因。挑選特異性表達和上調(diào)表達斑點克隆，經(jīng)擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行DNA序列測定。測序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.3 RNA的提取及cDNA的合成 分離6尾93日齡健康對蝦的血液以及心臟、肝胰腺、肌肉、胃、腸、眼柄等器官或組織，混合相同組織提取總RNA，同時分別取10、45、80、125日齡健康對蝦(各6尾)的肌肉組織，按Trizol(Invitrogen)試劑盒說明書的方法提取各器官或組織的總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄酶M－MLV的操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物作為PCR擴增的模板。

1.2.4 Sec61γ基因的克隆及序列分析 在NCBI搜索Sec61基因同源序列，用CAP3程序進行序列拼接。根據(jù)拼接的序列設(shè)計引物F1、R1見表1。PCR擴增體系為:0.5 μmol/L引物各2 μL，模板cDNA 2 μL，PCRmix 10 μL，加水補足 20 μL。擴增參數(shù)為:95℃下變性30 s，53℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，如此進行40個循環(huán);最后在72℃下延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠檢測、回收后，與pMD18－T載體連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中。陽性克隆的PCR產(chǎn)物送生工生物工程 (上海)有限公司測序。

使用NCBI網(wǎng)站 (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的Blastn和Blastx軟件進行同源基因的搜索;使用Gene Runner 3.05軟件進行開放閱讀框的搜索和氨基酸序列的推斷;使用Expasy工具包(http:∥www.expasy.ch/tools/pi_tool.html)進行PI和蛋白相對分子質(zhì)量的預(yù)測;用 SignalP 3.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測編碼蛋白的信號肽，用Tmhmm軟件 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/Tmhmm2.0)進行跨膜區(qū)預(yù)測。用Clustalx 2軟件對氨基酸的多序列進行排列;使用Mega 4.1軟件的鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹(Neighbor－joining tree)，設(shè)置1000 次bootstraps進行評估。

1.2.5 實時熒光定量PCR 實時熒光定量PCR是在ABI 7500 Fast Real－Time PCR儀上完成的。根據(jù)Sec61γ基因cDNA序列設(shè)計特異定量引物Sec1、Sec2，根據(jù)凡納濱對蝦內(nèi)參序列設(shè)計Beta－actin特異引物Actin1、Actin2(表1)。20 μL的PCR反應(yīng)體系中含有:2 μL cDNA，9 μL SYBR Green Master mix，5 μL RNAase－free H2O，上游和下游引物(0.5 μmol/L)各 2 μL。擴增參數(shù)為:95 ℃下預(yù)變性30 s;95℃下變性5 s，55℃下退火34 s，共進行40個循環(huán)。同一樣品的內(nèi)參和目的基因在同一板中進行，每個樣品做3個重復(fù)。實時定量RTPCR反應(yīng)及信息的收集都在ABI 7500 Fast Real－Time PCR 儀中進行。采用 2–ΔΔCt法計算 Sec61γ 基因mRNA的相對表達量，不同組織中的表達分析設(shè)定肌肉組織Sec61γ基因mRNA的表達量為1，不同時期表達分析設(shè)定10日齡Sec61γ基因mRNA的表達量為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA文庫的構(gòu)建與質(zhì)量檢測

本試驗中成功構(gòu)建了生長性狀差減文庫，共獲得1152個克隆。隨機挑選24個單克隆，以載體特異的M13正向引物和M13反向引物進行PCR擴增，大小分布在300～1000 bp，平均插入片斷大小為600 bp左右。

表1 本試驗中所用引物的序列Tab.1 Primer sequences used in the study

2.2 斑點雜交

將抑制消減文庫PCR中鑒定為單一條帶的產(chǎn)物點于尼龍膜上，共獲得768個基因片段的點陣膜，經(jīng)變性、中和及固定后與標記的探針進行雜交。將雜交后的信號曝光在X－ray film上 (圖1)，挑選較大對蝦和較小對蝦雜交信號差異顯著的克隆進行測序，從中選取一個420 bp的差異基因片段。

圖1 cDNA點陣膜雜交的結(jié)果Fig.1 The results of cDNA bitmap membrane hybrid

2.3 目的基因cDNA序列的特征

經(jīng)過同源序列搜索、序列拼接并設(shè)計引物，經(jīng)克隆得到的Sec61γ基因cDNA序列長為500 bp，包含270 bp的開放閱讀框 (ORF)，含1個ATG啟動子和1個TGA終止子。在編碼89個氨基酸中，帶正電的氨基酸 (Arg和Lys)有15個，帶負電的氨基酸 (Asp和Glu)有6個。理論等電點I為10.58，預(yù)測的相對分子質(zhì)量大小為10300。編碼的氨基酸序列經(jīng)Expasy推測在14～42氨基酸處存在1個Sec61γ標簽。經(jīng)Tmhmm預(yù)測Sec61γ在39～61氨基酸處有1個跨膜螺旋 (圖2)，用SignalP 3.0軟件預(yù)測無信號肽。

2.4 氨基酸序列比對及系統(tǒng)進化分析

Blastp搜索結(jié)果表明，凡納濱對蝦Sec61γ基因的編碼氨基酸序列與其它物種的同源性較高，但較穩(wěn)定。與有爪蟾蜍Xenopus laevis和穴居狼蛛lycosa singoriensis的相似性為84%;與小家鼠Mus musculus、文昌魚 Branchiostoma floridae、智人 Homo sapiens和玻璃海鞘Ciona intestinalis的相似性均為83%;與囊舌蟲Saccoglossus kowalevskii的相似性為77%(圖3)。所有分析物種與凡納濱對蝦Sec61γ基因跨膜螺旋區(qū)域 (39～61氨基酸)的序列一致。

運用Mega 4.1軟件構(gòu)建凡納濱對蝦Sec61γ基因和GenBank中12個物種Sec61基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹 (圖4)，Sec61γ基因氨基酸序列嚴格按照種屬關(guān)系聚成兩大支，分別是植物組和動物組。另外，凡納濱對蝦所在的甲殼綱在進化上與蛛形綱和腸鰓綱較近，而與昆蟲綱和脊椎動物亞門較遠。

使用Mega 4.1軟件的鄰接法構(gòu)建NJ系統(tǒng)樹，并用bootstraps進行了1000次評估。系統(tǒng)樹繪制所用基因的 GenBank登錄號如下:ACG76276.1 Amblyommaamericanum(美洲鈍眼蜱)，XP_002415993.1 Ixodes scapu(肩硬蜱)，ABX75489.1 Lycosa singoriensis(穴居狼蛛)，XP_002592130.1 Branchiostoma floridae(文昌魚)，XP_002734928.1 Saccoglossus kowalevskii(囊舌蟲)，XP_002426966.1 Pediculus humanus corporis(體虱)，NP_055117.1 Ho mosapiens(智人)，XP_003084563.1Musmusculus(小家鼠)，NP_001165129.1 Xenopus laevis(有爪蟾蜍)，NP_001027676.1 Ciona intestinalis(玻璃海鞘)，ADD20301.1 Glossina morsitans(刺舌蠅)，ABK21891.1 Picea sitchensis(北 美 云 杉)，ADB02901.1 Jatropha curcas(麻瘋樹)，XP_002270423.1 Vitis vinifera(葡萄)。

圖2 Sec61γ基因cDNA的核甘酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The cDNA nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Sec61γ gene

圖3 凡納濱對蝦的Sec61γ基因和其它物種Sec61基因的氨基酸序列比對Fig.3 Comparison of Sec61γ gene amino acid sequences in the Pacific white leg shrimp with other species.

2.5 Sec61γ基因的組織表達分布及在不同生長期肌肉中的表達

用實時熒光定量PCR方法檢測凡納濱對蝦Sec61γ基因在不同組織中的表達情況，結(jié)果如圖5所示。從圖5可見:Sec61γ基因在所檢測的組織中都有表達，其中在肌肉中的表達量最高，其次是胃、肝胰腺、心臟、眼柄以及血，最低的是腸。Sec61γ基因在對蝦不同生長時期肌肉中的相對表達量各不相同，在45日齡對蝦肌肉中的表達量最低，在10日齡對蝦肌肉中的表達量最高，為45日齡的27.6倍。

3 討論

圖4 構(gòu)建的Sec61γ基因氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Sec61γ gene amino acid sequences

圖5 Sec61γ基因在對蝦不同生長期的肌肉中以及在不同組織中的相對表達量Fig.5 Expression of Sec61γ gene in the muscles of different organs/tissues during different growth periods

生物細胞中大多數(shù)蛋白 (包括許多細胞器蛋白)常常通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng) (ER)進行運輸。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運通道Sec61復(fù)合體具有3種蛋白亞基——Sec61α、Sec61β和Sec6γ，其中Sec61α具有10個跨膜區(qū)，而 Sec61β和 Sec61γ僅有一個跨膜區(qū)［9－10］。本研究中涉及的 Sec61γ基因也是一個跨膜蛋白 (圖2)，跨膜螺旋區(qū)域位于39～61氨基酸處。與其它物種的氨基酸序列進行比對，結(jié)果表明:凡納濱對蝦Sec61γ基因與有爪蟾蜍和穴居狼蛛的相似性為84%，與小家鼠、文昌魚、智人和玻璃海鞘的相似性均為83%，與囊舌蟲的相似性為77%，與所比對的7種物種在凡納濱對蝦Sec61γ基因的跨膜螺旋區(qū)域處的氨基酸序列完全一致 (圖3)。這表明該氨基酸的跨膜區(qū)域是高度保守的，推測Sec61γ的跨膜區(qū)域?qū)τ谄涔δ艿陌l(fā)揮具有重要的作用。由構(gòu)建的NJ進化樹體系可知(圖4)，其由兩個主要分支組成，動物和植物分別聚為一簇，同屬一綱的物種也相應(yīng)聚成一個分枝，準確地體現(xiàn)了物種的進化關(guān)系。進化樹還顯示，凡納濱對蝦所屬的甲殼綱在進化上同蛛形綱和腸鰓綱較近，而與昆蟲綱和脊椎動物亞門較遠，這為我們進一步研究節(jié)肢動物門中多個綱的進化關(guān)系及起源提供了參考資料。

本研究中涉及的Sec61γ基因通過實時熒光定量PCR方法檢測到其在血液以及心臟、肝胰腺、肌肉、胃、腸、眼柄等器官或組織中都有表達，且在肌肉中表達量最高。凡納濱對蝦的出肉率高達53.03% ～53.81%［11］，因此對蝦的生長主要體現(xiàn)在肌肉的生長。生長快的對蝦，其肌肉的生長也相應(yīng)較快，同時需要大量蛋白質(zhì)和必需氨基酸，而Sec61γ蛋白的大量表達則可能促進肌肉細胞蛋白質(zhì)的合成以及增加物質(zhì)運輸。另外，Sec61通道是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一個雙向轉(zhuǎn)運蛋白的通道［12］，在形成一個疏水通道讓新生多肽通過的同時，也可能促進肌肉代謝中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物的快速運輸，從而保證肌肉細胞代謝活動的正常運行。本研究結(jié)果表明，Sec61γ基因在對蝦不同生長期肌肉中的表達量各不相同，其中在10日齡對蝦肌肉中表達量最高，45日齡時表達量最低，80日齡時表達量又大幅上升，125日齡時表達量又回落，結(jié)果有待在不同家系的對蝦中進一步驗證。下一步將對Sec61復(fù)合體其它蛋白亞基——Sec61α、Sec61β的表達模式進行研究，這將有助于人們更深入地探討Sec61基因的功能。

［1］Cannon K S，Or E，Clemons W M Jr，et al.Disulfide bridge formation between Sec61γ and a translocating polypeptide localizes the translocation pore to the center of Secγ［J］.Cell Biol，2005，169(2):219－225.

［2］Beckmann R，Bubeck D，Grassucci R，et al.Alignment of conduits for the nascent polypeptide chain in the ribosome Sec61 complex［J］.Science，1997，278(5346):2123－2126.

［3］Cheng Z，Jiang Y，Mandon E C，et al.Identification of cytoplasmic residues of Sec61pinvolved in ribosome binding and cotranslational translocation［J］.Cell Biol，2005，168:67－77.

［4］Rapoport T A，Rolls M M，Jungnickel B.Approaching the mechanism of protein transport across the ER membrane［J］.Curr Opin Cell Biol，1996，8(4):499－504.

［5］Heinrch S U，Mothes W，Brunner J，et al.The Sec61p complex mediates the integration of a membrane protein by allowing lipid partitioning of the transmembrane domain［J］.Cell，2000，102:233 －244.

［6］Or E，Boyd D，Gon S，et al.The bacterial ATPase SecA functions as a monomer in protein translocation［J］.Biol Chem，2005，280:9097－9105.

［7］Valcarcel R，Weber U，Jackson D B，et al.Sec61 beta，a subunit of the protein translocation channel，is required during Drosophila development［J］.Cell Sci，1999，112:4389－4396.

［8］Meyer H A，Grau H，Kraft R，et al.Mammalian Sec61 is associated with Sec62 and Sec63［J］.Biol Chem，2000，275:14550－14557.

［9］DIatchenko L，Lau Y F，Campbell A P，et al.Suppression subtractive hybridization:a method for generating differentially regulated of tissue－specific cDNA probes and libraries［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93:6025－6030.

［10］Wickner W，Schekman R.Protein translocation across biological membranes［J］.Science，2005，310:1452－1456.

［11］Becker T，Bhusshan S，Jarasch A，et al.Structure of monomeric yeast and mammalian Sec61 complexes interacting with the translating ribosome［J］.Science，2009，326:1369－1373.

［12］陳曉漢，陳琴，謝達祥.南美白對蝦含肉率及肌肉營養(yǎng)價值的評定［J］.水產(chǎn)科技情報，2001(4):165－168.