劉海映，秦玉雪，姜玉聲，王桂娥

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋牧場(chǎng)工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023;2.大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116023)

口蝦蛄Oratosquilla oratoria俗稱蝦爬子、螳螂蝦、蝦虎、琵琶蝦等，又名“東方蝦蛄”，隸屬節(jié)肢動(dòng)物門、甲殼綱、口足目、蝦蛄科、口蝦蛄屬，是常見(jiàn)的海洋經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物?？谖r蛄主要分布于包括中國(guó)在內(nèi)的西北太平洋諸國(guó)近海。其肉味鮮美，有很高的食用價(jià)值。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈與近海環(huán)境的破壞，導(dǎo)致口蝦蛄資源嚴(yán)重衰退，自然產(chǎn)量很難滿足市場(chǎng)需求。因此，口蝦蛄生物學(xué)及其人工育苗與養(yǎng)成技術(shù)的研究已引起人們的關(guān)注。

Hamano 等［1－4］和 Matsuura 等［5］于 20 世紀(jì) 80年代開始研究了口蝦蛄對(duì)人工洞穴的選擇、交配行為、產(chǎn)卵和護(hù)卵行為、攝食等。Ohtomi等［6］和濱野龍夫［7－8］分別對(duì)口蝦蛄的產(chǎn)卵場(chǎng)特征、產(chǎn)卵動(dòng)態(tài)和蝦蛄的洞穴及相關(guān)生態(tài)特性進(jìn)行了研究。王春琳等［9］、徐善良等［10］、劉海映等［11］對(duì)口蝦蛄的生物學(xué)特征及其繁殖生物學(xué)進(jìn)行了研究;孫丕喜等［12］、王波等［13］、閻斌倫等［14］相繼對(duì)口蝦蛄的人工育苗技術(shù)進(jìn)行了探索。另外，王春琳等［15－16］還對(duì)口蝦蛄之近親——黑斑口蝦蛄Oratosquilla kempi的人工育苗技術(shù)及其胚胎和幼體發(fā)育時(shí)期脂類與脂肪酸的組成進(jìn)行了研究。然而，有關(guān)口足目動(dòng)物胚胎發(fā)育的研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)中，作者在室內(nèi)控溫條件下培育口蝦蛄親體，跟蹤觀察產(chǎn)卵與胚胎發(fā)育的過(guò)程，旨在為口蝦蛄的個(gè)體發(fā)育研究及其人工繁殖提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2009年4月28—30日，于大連市普蘭店沿海收購(gòu)已交配的雌蝦蛄。選擇體表無(wú)傷殘、健康有活力的口蝦蛄 (210尾)作為試驗(yàn)用親蝦蛄。每尾體長(zhǎng)為12 cm左右，體質(zhì)量為32 g。

1.2 方法

1.2.1 培育池 培育池為30 m3的水泥池，其中鋪設(shè)10 cm厚的海沙，埋入80個(gè)人工洞穴 (聚乙烯管直徑為6 cm);2個(gè)2.4 m3的玻璃鋼觀察池，其中鋪設(shè)5 cm厚的海沙，各放置12個(gè)人工洞穴，此洞穴為綠色透明管狀，半埋入沙中，以便觀察蝦蛄的產(chǎn)卵情況。池子上方覆蓋雙層遮陰網(wǎng)。采用加熱器控制水溫。

1.2.2 親蝦蛄培育 將親蝦蛄于培育池中暫養(yǎng)，日換水量為1/2，水溫恒定為 (18±1)℃。每日早晚各投喂1次鮮活菲律賓蛤仔和沙蠶。培育前期，親蝦蛄的攝食量較大，投餌前檢查以少有剩余為標(biāo)準(zhǔn)，確保親蝦蛄的營(yíng)養(yǎng);培育后期，待產(chǎn)親蝦蛄的攝食明顯減少，此時(shí)應(yīng)減少投餌，并及時(shí)清除殘餌，保證水質(zhì)良好。挑取臨產(chǎn)的親蝦蛄轉(zhuǎn)入觀察池，每日升溫1℃，至21℃時(shí)保持恒定，以促使產(chǎn)卵。

1.2.3 胚胎發(fā)育觀察 口蝦蛄預(yù)產(chǎn)卵期間，每隔2 h觀察一次，及時(shí)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)卵口蝦蛄，用鑷子取卵，并記錄產(chǎn)卵時(shí)間。胚胎發(fā)育前期，每隔30 min取卵細(xì)胞15粒于顯微鏡 (Olympus CX41RF)下觀察并拍照;后期胚胎發(fā)育速度較慢，取樣頻率隨之降低，自囊胚期開始每隔8 h取卵1次。產(chǎn)卵與取樣觀察期間，采用加熱器控制水溫在 (21±1)℃。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)卵

前期的研究發(fā)現(xiàn)，溫度對(duì)口蝦蛄性腺發(fā)育影響顯著，水溫為 (18±1)℃時(shí)性腺發(fā)育較快，而水溫為 (24±1)℃時(shí)性腺發(fā)育緩慢 (結(jié)果另文發(fā)表)。因此，本試驗(yàn)中將親蝦蛄的培育溫度控制為18℃左右。

親蝦蛄為俯臥產(chǎn)卵，其間以3對(duì)步足支撐洞壁，有時(shí)也用第二顎足和尾扇支撐，顎足輔助收攏卵團(tuán)。剛產(chǎn)出的卵不粘連，隨后卵粒間被附屬腺分泌物連接。每個(gè)卵周圍有多個(gè)卵柄，卵間形成立體的空間，而整個(gè)卵團(tuán)也逐漸被一膜狀物包裹。每尾口蝦蛄的抱卵量約為3～5萬(wàn)粒。卵團(tuán)由第一、三、四、五顎足抱于頭胸部腹面，第二顎足用于防敵和輔助翻動(dòng)、折疊卵團(tuán)。取卵操作時(shí)，親蝦蛄受到刺激后，會(huì)緊抱卵團(tuán)迅速返回洞穴深處躲避，有時(shí)甚至棄卵逃離，少數(shù)棄卵親蝦蛄待穩(wěn)定后，能主動(dòng)抱回卵團(tuán)。人工送還卵團(tuán)能協(xié)助親蝦蛄重新抱卵，但對(duì)同一親蝦蛄連續(xù)多次取卵會(huì)導(dǎo)致卵停止發(fā)育，最終死亡。

2.2 胚胎發(fā)育

口蝦蛄受精卵行不完全表面卵裂，胚胎發(fā)育經(jīng)過(guò)受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸胚期、膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期、膜內(nèi)溞狀幼體期等典型時(shí)期。水溫為(21±1)℃時(shí)，受精卵經(jīng)過(guò)18 d孵化為Ⅰ期假溞狀幼體。

2.2.1 受精卵 剛產(chǎn)出的受精卵為不甚規(guī)則的球形，之后逐漸變圓，卵徑為410～450 μm。卵黃量較多，分布于卵子中央，原生質(zhì)分布于卵球表面，屬中黃卵，卵為淺黃色 (圖1－A1、B)。卵粒間由附屬腺分泌的“卵柄”相連 (圖1－C)。

2.2.2 卵裂期 產(chǎn)卵后1 h(圖1－A2)，卵裂開始。此時(shí)卵質(zhì)與卵黃分開，之間出現(xiàn)一明顯裂溝，胚胎與卵膜出現(xiàn)明顯分離 (圖1－A3)。口蝦蛄受精卵為表面卵裂。經(jīng)過(guò)10 h左右，受精卵不斷分裂，依次進(jìn)入4細(xì)胞期 (圖1－A4)、8細(xì)胞期 (圖1－A5)、16細(xì)胞期 (圖1－A6)至32細(xì)胞期 (圖1－A7)，此時(shí)可以見(jiàn)到分裂球大小不一，排列不整齊。

2.2.3 囊胚期 產(chǎn)卵后25 h，細(xì)胞進(jìn)一步分裂，數(shù)量不斷增多，單個(gè)細(xì)胞體積不斷變小，且無(wú)規(guī)則形狀，沿著卵黃外緣下包，形成表面囊胚。此時(shí)，囊胚呈球形，四周一層細(xì)胞包圍著中央的卵黃(圖1－A8)，受精卵進(jìn)入囊胚期。

2.2.4 原腸胚期 產(chǎn)卵后4 d，胚胎的一端出現(xiàn)透明區(qū)域，標(biāo)志著進(jìn)入原腸胚期。胚胎近前端不斷分裂的細(xì)胞形成胚區(qū)(germinal area)，隨后其邊緣形成一半圓形溝，此處細(xì)胞逐漸內(nèi)陷，以此方式形成原腸 (圖1－A9)。陷入處即為原口或胚孔 (blasto pore)，是原腸腔與外界相通的開口，而整個(gè)區(qū)域稱為內(nèi)胚層盤。陷入的內(nèi)胚層細(xì)胞吸收卵黃，逐漸由內(nèi)向外擴(kuò)展，較大的細(xì)胞在原口邊緣呈圓錐柱狀，其胞核與胞質(zhì)靠外端，而內(nèi)端充滿卵黃。同時(shí)，囊胚腔逐漸縮小，由新生的原腸腔取代。原口形成后，胚區(qū)前端兩側(cè)的細(xì)胞迅速增殖，形成圓盤狀的細(xì)胞群，左右對(duì)稱排列，此為視葉原基，隨后將發(fā)育為視葉，最終成為一對(duì)復(fù)眼 (圖1－A9)。原腸胚后期，原口兩側(cè)形成兩個(gè)密集的細(xì)胞群，為腹板的原基。隨著細(xì)胞的增殖，原基不斷增大，并向原口處合并成為胸腹突。原口則被不斷增大的胸腹突所封閉，最終消失。

2.2.5 膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期 產(chǎn)卵后7 d，同側(cè)視葉原基與胸腹突之間的細(xì)胞密度較其它部位增加，形成左右對(duì)稱的兩個(gè)細(xì)胞團(tuán)，并逐漸增大且向外側(cè)突出，發(fā)育成為大顎原基。在大顎原基與視葉原基之間，靠近大顎原基，出現(xiàn)一對(duì)細(xì)胞群突起，此為第二觸角原基。隨后，在第二觸角原基與視葉原基之間又出現(xiàn)一對(duì)細(xì)胞群突起，為第一觸角原基。大顎、第一觸角與第二觸角原基的出現(xiàn)是甲殼動(dòng)物膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期的標(biāo)志［17］。胸腹突不斷增長(zhǎng)、增厚，其末端凹陷，胚胎前端兩側(cè)的視葉原基細(xì)胞不斷增殖，形成視葉 (圖1－A10)。此時(shí)，卵由黃色變?yōu)辄S褐色。

口蝦蛄與其它甲殼動(dòng)物一樣都以末端芽殖的方式產(chǎn)生新的體節(jié)與附肢。無(wú)節(jié)幼體3對(duì)附肢所對(duì)應(yīng)的3個(gè)體節(jié)已完全愈合，之后在大顎節(jié)與尾節(jié)之間通過(guò)出芽形成新的體節(jié)及相應(yīng)的附肢，自第一小顎開始，逐節(jié)發(fā)生?？谖r蛄無(wú)節(jié)幼體期后期，頭胸部形成兩對(duì)小顎原基、兩對(duì)顎足原基。胸腹突增長(zhǎng)，出現(xiàn)體節(jié)。在胸腹突的背側(cè)出現(xiàn)皺褶，為頭胸甲原基。

2.2.6 膜內(nèi)溞狀幼體期 產(chǎn)卵后11 d，隨著胚胎透明部分所占比例的明顯增加，卵黃的比例相應(yīng)減少。復(fù)眼原基部位出現(xiàn)色素顆粒，標(biāo)志著胚胎發(fā)育至溞狀幼體期 (圖1－A11)。無(wú)節(jié)幼體期形成的3對(duì)附肢進(jìn)一步增長(zhǎng)、分節(jié)，呈肢芽狀，末端出現(xiàn)剛毛。隨著胸腹突細(xì)胞的不斷增殖，在胸腹突基部相繼形成3對(duì)步足原基?？捎^察到胸腹突末端背側(cè)的心臟出現(xiàn)緩慢不規(guī)則地跳動(dòng)。后期，頭胸甲形成，胚胎分節(jié)明顯，解剖能夠較容易地區(qū)分頭胸部、胸部和腹部 (圖1－A12)。臨近破膜時(shí)，心跳連續(xù)，頻率加快，胚胎有收縮動(dòng)作，并越加劇烈 (圖1－D)。

圖1 口蝦蛄的胚胎發(fā)育Fig.1 Embryonic development of the mantis shrimp

3 討論

3.1 胚胎發(fā)育的分期

胚胎發(fā)育是動(dòng)物個(gè)體發(fā)育與進(jìn)化生物學(xué)研究的重要內(nèi)容之一。蝦蟹類動(dòng)物種類眾多，胚胎發(fā)育的形式復(fù)雜多樣，其生物學(xué)特征往往因種而異。對(duì)于有抱卵習(xí)性的種類，胚胎發(fā)育往往要經(jīng)歷一段膜內(nèi)幼體時(shí)期。中華絨螯蟹經(jīng)歷膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體和膜內(nèi)溞狀幼體期而孵化出膜［18］，而河流溪蟹等在淡水中繁殖的蟹類除了要經(jīng)歷上述兩個(gè)發(fā)育時(shí)期外，還存在卵內(nèi)大眼幼體期［19－20］。目前，有關(guān)蝦蟹類膜內(nèi)幼體的分期尚無(wú)統(tǒng)一觀點(diǎn)。趙云龍等［21］將羅氏沼蝦的胚胎發(fā)育過(guò)程分為卵裂期、囊胚期、原腸期、前無(wú)節(jié)幼體期、后無(wú)節(jié)幼體期、前溞狀幼體期和溞狀幼體期7個(gè)時(shí)期。慕峰等［22］認(rèn)為，克氏原螯蝦的胚胎發(fā)育可以分為受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸期、前無(wú)節(jié)幼體期、后無(wú)節(jié)幼體期、復(fù)眼色素期、預(yù)備孵化期和孵化期9個(gè)主要時(shí)期。依據(jù)不同時(shí)期胚胎的典型特征，細(xì)化分期無(wú)疑將有助于深入解析個(gè)體發(fā)育的生物學(xué)機(jī)理，但對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用則略顯繁瑣。本研究中，作者綜合現(xiàn)有觀點(diǎn)，將口蝦蛄胚胎發(fā)育過(guò)程分為受精卵、卵裂期、囊胚期、原腸期、膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期、膜內(nèi)溞狀幼體期6個(gè)主要時(shí)期。其中膜內(nèi)無(wú)節(jié)幼體期與膜內(nèi)溞狀幼體的分期分別以大顎、第一觸角與第二觸角3對(duì)附肢原基的出現(xiàn)，以及視葉色素的出現(xiàn)為劃分依據(jù)。本研究結(jié)果表明，口足類動(dòng)物個(gè)體發(fā)育過(guò)程更接近于蟹類與螯蝦類，但與無(wú)節(jié)幼體時(shí)期就破膜孵化的對(duì)蝦類差異明顯［17］，進(jìn)而從發(fā)育學(xué)角度證明了口足類在甲殼動(dòng)物中具有較高等的進(jìn)化地位。

3.2 水溫與胚胎發(fā)育時(shí)間

據(jù)報(bào)道，水溫為26℃時(shí)，羅氏沼蝦Macrobrachium rosenbergi和紅螯螯蝦Cherax quadricarintus的胚胎發(fā)育時(shí)間分別為20 d和30 d以上［23－24］。本研究結(jié)果表明，在平均水溫為21℃時(shí)，口蝦蛄胚胎歷時(shí)18 d孵化出膜，與胚胎發(fā)育過(guò)程相似的羅氏沼蝦和紅螯螯蝦相比速度較快。據(jù)日本學(xué)者Hamano等［25］報(bào)道，蝦蛄胚胎孵化時(shí)間與水溫呈正相關(guān)，其關(guān)系式為D=58.39－1.85T(R=－0.98)。由此可知，溫度越高，胚胎的孵化時(shí)間越短。然而，本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)孵化溫度高于24℃時(shí)，口蝦蛄棄卵嚴(yán)重，胚胎易壞死或停滯發(fā)育。這說(shuō)明口蝦蛄胚胎正常發(fā)育的上限溫度可能為21～24℃，而準(zhǔn)確的溫度上限有待于進(jìn)一步研究。

3.3 胚胎的離體孵化

人工采卵易導(dǎo)致親蝦蛄產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)破壞卵團(tuán)的完整，受精卵容易壞死。因此，試驗(yàn)期間難以從同一個(gè)體的卵團(tuán)中取卵，致使胚胎發(fā)育觀察不連續(xù)。本試驗(yàn)中通過(guò)增加取樣群體數(shù)量，并采取分別記錄、取樣的方法，將整個(gè)胚胎發(fā)育過(guò)程連接，以保證結(jié)果完整。然而取樣個(gè)體的差異也會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，在掌握口蝦蛄受精卵發(fā)育最適條件的基礎(chǔ)上，建立離體孵化技術(shù)是解決這一問(wèn)題的有效途徑。

據(jù)報(bào)道，日本沼蝦Macrobrachium mipponensis離體受精卵在適當(dāng)條件下能夠正常孵化［26］。鋸緣青蟹離體受精卵也能正常發(fā)育，孵化率達(dá)95%［27］。本試驗(yàn)中多次取出孵化早期 (受精卵、二細(xì)胞期、8細(xì)胞期、囊胚期)的口蝦蛄卵進(jìn)行離體孵育，但發(fā)現(xiàn)離體卵不能正常發(fā)育，隨著離體孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，胚胎顏色變深，并大量死亡?？谖r蛄受精卵的離體孵化技術(shù)還有待于進(jìn)一步研究。

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