夏英定,汪世平,李 娟,吳昌義,田 智,尹鐵球,周云飛,張樹菊,馮其梅

2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣州 510642

日本血吸蟲病是一種引起嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題的人獸共患寄生蟲病,是世界衛(wèi)生組織確定的六大重點(diǎn)熱帶病之一[1-2],也是我國政府高度重視并重點(diǎn)防治的四大傳染病之一。目前,我國仍有173個(gè)縣1 579個(gè)鄉(xiāng)(鎮(zhèn))處于血吸蟲病的流行狀態(tài),估計(jì)患者56.60萬[3]。

線粒體DNA(m tDNA)結(jié)構(gòu)簡單、穩(wěn)定、以母系方式遺傳,核苷酸歧異度大、進(jìn)化速度快于或等于核DNA[4-5],在種間、種內(nèi)、群體間和群體內(nèi)均具有廣泛的多態(tài)性。m tDNA序列可以提供有效的分子標(biāo)記用于種群分類、示蹤個(gè)體或相關(guān)特殊種群的基因發(fā)展歷史,同時(shí)還可用于構(gòu)建種系發(fā)育中更細(xì)致的分支[6],目前已在寄生蟲的種類鑒定及種系發(fā)育研究中得到應(yīng)用[7-8]。PCR-SSCP是20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來的一種DNA突變檢測技術(shù)[9-10],方法靈敏并具備適于大樣本快速篩選等特點(diǎn),是遺傳變異研究常用方法之一[11]。本研究對采自湖南5個(gè)不同地區(qū)日本血吸蟲樣本的線粒體atp6基因部分序列進(jìn)行了PCR-SSCP篩選和遺傳變異的多態(tài)性分析,旨在為湖南不同自然隔離群日本血吸蟲的遺傳特性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲體來源 本研究所用的日本血吸蟲成蟲樣品,分別采自湖南長沙橘子洲、常德澧縣、岳陽樓區(qū)與君山區(qū)和汨羅磊石5個(gè)流行區(qū)的野生陽性釘螺,經(jīng)家兔感染傳代而獲得蟲樣,有關(guān)信息見表1。

表1 研究中使用的湖南省日本血吸蟲樣品來源及其atp6序列信息Tab le1 In formation of atp6 sequences of S.japonicum from Hunan Province used in present study

1.2 主要儀器與試劑 DNA提取試劑盒、Ex Taq酶、DL-2000 DNA Marker、rTaq酶,凝膠成像系統(tǒng),Bio-RAD電泳系統(tǒng),凝膠圖像分析系統(tǒng),PCR試劑。

1.3 蟲體材料的處理 從70%酒精保存液中取出單個(gè)成蟲(雌雄合抱的成蟲用鑷子輕輕分離為雌、雄兩條)。將雌、雄蟲分裝于新的1.5m L Eppendorf管中,用蒸餾水反復(fù)沖洗3次。

1.4 DNA提取、鑒定 按Geneaid公司DNA提取試劑盒(Genomic DNA miniKit protocol-Tissue)說明書操作,抽提DNA樣品用于下一步的擴(kuò)增。

1.5 atp6部分序列擴(kuò)增及鑒定 根據(jù)GenBankTM上已發(fā)表的atp6基因序列設(shè)計(jì)1對特異引物,上游引 物 (atp6u):5′-TA TCTGGGTTA TGGTTTACTAGA-3′, 下 游 引 物 (atp6d):5′-CGACAGAAAACT TAAGTATCTCT-3′,引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)采用25μL體系:10×緩沖液 2.5μL,dNTPs(2.5mmol/L)2μL,MgCl2(25mm ol/L)2.5μL,上 下游 引物 各0.5μL(50pmol/μL),rTaq 0.25μL,gDNA 1μL。反應(yīng)條件:94℃ 5min;94℃1min,55℃30s,72℃1min,33個(gè)循環(huán);72℃5min。經(jīng)1.0%的瓊脂糖凝膠電泳分析,EB染色后于凝膠成像系統(tǒng)鑒定并拍照。

1.6 SSCP[12]篩選及鑒定 取3μL陽性PCR產(chǎn)物和5μL變性載樣緩沖液混勻,94℃變性10min后,立即置于冰浴中驟冷5min后上樣,6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。12～20℃,90 V電泳約300min。電泳結(jié)束后,取下凝膠,雙蒸水漂洗2次;將凝膠放入濃度0.25m g/L EB染色液中染色30min后于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

1.7 測序 根據(jù)SSCP分析結(jié)果,選擇SSCP帶型不同的代表性樣品(篩選時(shí),將特異條帶的相鄰條帶的樣品一并測序,以作比較),共篩選出13個(gè)具有代表性的atp6部分基因樣品,PCR擴(kuò)增后,將PCR產(chǎn)物直接送華大基因科技股份有限公司有限公司測序。

1.8 變異分析 將21份樣品的測序結(jié)果用DNAStar 5.0和Mega 4.0軟件進(jìn)行多態(tài)性分析和系統(tǒng)發(fā)育研究。

2 結(jié) 果

2.1 atp6部分基因SSCP篩選及PCR擴(kuò)增結(jié)果atp6部分基因經(jīng)SSCP篩選后,通過6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定,結(jié)果見圖1。

圖1 atp6部分基因SSCP篩選后聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.1 SSCP selection resu lts of atp6 by PAGE

從35份樣品中篩選出具有代表性的atp6部分基因13份,以及長沙橘子洲和岳陽樓區(qū)樣品8份,對此21份樣品進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后,在約500bp處呈現(xiàn)1條特異性條帶(見圖2),與預(yù)期的片段大小吻合,且無非特異性條帶,說明本研究設(shè)計(jì)的PCR引物及反應(yīng)條件具有較好的特異性。

圖2 atp6部分基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR resu lts of atp6

2.2 atp6序列測定及其變異與發(fā)育分析 將測序獲得的21份樣品atp6部分序列用DNAStar5.0軟件比對(結(jié)果見圖3)分析發(fā)現(xiàn),湖南省日本血吸蟲各分離株的483 bp atp6基因序列中有17個(gè)變異位點(diǎn)(3.52%),其中16處發(fā)生了轉(zhuǎn)換(G-T轉(zhuǎn)換有3次、C-T轉(zhuǎn)換有 7次、A-G轉(zhuǎn)換有 5次、C-A 轉(zhuǎn)化1次),其中C-T轉(zhuǎn)換頻率最高,C-A轉(zhuǎn)換頻率最低(見表2)。所得的atp6序列中A,G,T,C堿基平均含量分別為20.91%,21.33%,48.24%,9.52%,其中A+T平均含量為69.15%明顯高于C+G平均含量30.85%。遺傳差異分析表明雌雄蟲之間的差異為0.0%～1.3%,各個(gè)蟲株間的差異0.0%～1.5%,不同地理來源蟲株間的差異為率0.0%～1.5%(表3)。

表2 atp6部分序列的變異情況Tab le 2 Variation of nucleotideacids sequences of each atp6

表3 各atp6部分序列的差異性比較Table 3 Differences nucleotide sequence among each atp6

種系發(fā)育分析表明,湖南省不同地域自然隔離群日本血吸蟲分離株線粒體atp6基因的個(gè)體遺傳差異明顯,尤以汨羅和岳陽君山兩地分離蟲株表現(xiàn)突出(圖4)。

3 討 論

日本血吸蟲存在明顯的種和株間變異[13],由于自然環(huán)境的隔離,采用傳統(tǒng)的分類方法已無法解釋日本血吸蟲各地域株的遺傳分化的特征。m tDNA作為遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于寄生蟲的種類鑒定、遺傳多態(tài)性和種群結(jié)構(gòu)及種系發(fā)育等研究。Sorensen和Zhao等[14-15]分別通過不同的方法對中國大陸日本血吸蟲蟲線粒體nad 1,nad 4,nad 5,cox3基因進(jìn)行了遺傳多態(tài)性和種系發(fā)育以及種群內(nèi)遺傳變異的分析。Zarow iecki[16]等利用滑行窗口技術(shù)分析了血吸蟲線粒體基因組,揭示atp6基因具有最低的變異堿基數(shù)和最豐富的信息內(nèi)容。甚至還有人用線粒體atp6基因和其他線粒體基因作為分子標(biāo)記來研究胡蘿卜野生品種與和人工培養(yǎng)品種間的遺傳變異情況[17-19]。Gudewar[20]等也報(bào)道了關(guān)于在印度同一地域里細(xì)粒多棘球絳蟲病的兩種不同基因型的線粒體基因atp6和nad2基因特性,并認(rèn)為以其線粒體atp6和nad2基因分析結(jié)果可以指示該基因型的傳播情況。但迄今為止,尚未見不同地域自然隔離群日本血吸蟲分離株線粒體atp6基因遺傳變異研究的報(bào)道。

本研究對來自我國湖南省5個(gè)不同流行地區(qū)的21份日本血吸蟲樣品進(jìn)行了atp6部分基因序列的遺傳多態(tài)性分析。結(jié)果表明來自不同流行區(qū)的21個(gè)樣品總體變異率為3.52%,種內(nèi)各個(gè)蟲株間差異在0.0%～1.5%之間。種系發(fā)育分析表明,湖南省不同地域自然隔離群日本血吸蟲分離株線粒體atp6基因的個(gè)體遺傳差異十分明顯,尤以汨羅和岳陽君山兩地分離蟲株表現(xiàn)突出,出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象的原因可能與日本血吸蟲線粒體atp6基因進(jìn)化活躍的遺傳特征有關(guān)。同時(shí),或許因?yàn)楹^(qū)年年不斷的漲水季節(jié)造成釘螺的遷移,導(dǎo)致相鄰地域之間蟲株互換頻繁,故發(fā)生個(gè)體之間遺傳特征的交叉現(xiàn)象。此外,湖南省流行區(qū)內(nèi)長期使用大量化學(xué)藥物進(jìn)行滅螺滅蚴工作,也可能導(dǎo)致該地區(qū)日本血吸蟲由于藥物選擇壓力的加大,以致進(jìn)化速度加快。但是,是否由于生存環(huán)境的選擇壓力造成了同一地理來源日本血吸蟲個(gè)體之間atp6基因的遺傳差異,其原因尚有待于進(jìn)一步研究。

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