宮航宇，綦盛麟，石 銘，宋連平

大連市第六人民醫(yī)院，遼寧大連 116031

據(jù)估計(jì)每年大約有3.5億人感染慢性乙肝，乙肝攜帶者有更高的風(fēng)險(xiǎn)發(fā)展成為肝硬化、肝功能失代償和肝癌[1-2]。治療這些患者的長(zhǎng)期目標(biāo)是阻止他們發(fā)展成為肝硬化和肝癌。然而這個(gè)長(zhǎng)期目標(biāo)在臨床上是不實(shí)用的。在治療后1年或更短時(shí)間的跟蹤中，通常采用更加切實(shí)可行的短期目標(biāo)。較為廣泛應(yīng)用的短期目標(biāo)是血清ALT水平的復(fù)常和血清HBV-DNA水平的降低[3-4]。這些指標(biāo)反映了肝臟生化水平的改善和病毒復(fù)制的抑制。

目前用于治療慢性乙肝和療效觀察的藥物主要分為兩大類(lèi)：免疫調(diào)節(jié)劑和核苷類(lèi)似物。α-干擾素是最為熟知的免疫調(diào)節(jié)劑，拉米夫定是研究最深入的核苷類(lèi)似物藥物[5]。干擾素在白種人身上較為有效，而用于亞洲人則差強(qiáng)人意。拉米夫定對(duì)于血清ALT水平的復(fù)常、e抗原轉(zhuǎn)陰、血清HBVDNA的下降都很有效。然而長(zhǎng)期拉米夫定治療會(huì)導(dǎo)致HBV聚合酶基因YMDD基序突變的產(chǎn)生[6-8]。隨著突變病毒株的產(chǎn)生，對(duì)拉米夫定治療越來(lái)越有耐藥性。在許多研究中，拉米夫定和α-干擾素聯(lián)合用藥被用于克服治療中耐藥性的產(chǎn)生，并且這種療法可以減少或延遲YMDD突變的產(chǎn)生。拉米夫定和α-干擾素序貫治療可以誘導(dǎo)對(duì)α-干擾素單獨(dú)治療無(wú)應(yīng)答的患者產(chǎn)生持續(xù)的病毒應(yīng)答。同時(shí)又不會(huì)引起耐藥突變株的優(yōu)勢(shì)選擇。序貫聯(lián)合治療可以誘導(dǎo)e抗原陰性HBVDNA陽(yáng)性的乙肝患者產(chǎn)生持續(xù)的病毒應(yīng)答。與聯(lián)合治療相比，對(duì)乙肝患者采用拉米夫定和α-干擾素序貫治療的有效性仍需進(jìn)一步探索。

本研究中，筆者評(píng)價(jià)了拉米夫定和α-干擾素序貫治療e抗原陰性乙肝患者的功效，還采用了一種基于Taqman技術(shù)的實(shí)時(shí)PCR方法調(diào)查治療過(guò)程中的拉米夫定突變。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究進(jìn)行于2002年6月～2004年7月，共有162例未經(jīng)抗病毒治療的患者進(jìn)行了該序貫治療的研究。所有患者均＞16 歲，平均年齡（34.0±11.2）歲；其中，男 108 例，女 54例；HBsAg持續(xù)陽(yáng)性至少6個(gè)月、HBeAg陰性、anti-HBe陽(yáng)性、HBV-DNA水平＞105copies/ml，血清ALT水平高于正常范圍的1.5倍，小于10倍（根據(jù)中國(guó)拉米夫定應(yīng)用專(zhuān)家共識(shí)）。患者排除標(biāo)準(zhǔn)包括乙肝與甲、丙、丁、戊肝以及HIV共感染者、失代償性肝病或者肝癌患者、1年內(nèi)有酒精或毒品濫用史者、其他可能引起慢性肝損傷的原因以及經(jīng)過(guò)治療的乙肝患者。

患者治療前的基本信息見(jiàn)表1。98例患者根據(jù)隨機(jī)安排接受拉米夫定治療，64例患者接受拉米夫定和α-干擾素的序貫治療。

1.2 研究設(shè)計(jì)和治療方案

按照2∶3的比例將患者隨機(jī)分為兩組。A組64例接受序貫治療，B組98例接受拉米夫定單獨(dú)治療。本研究按照Helsinki指南和GCP條例進(jìn)行，所有的患者均被告知并表示同意。

表1 患者基本信息

A組患者接受拉米夫定（100 mg/d，葛蘭素）治療20周，然后用α-2b干擾素（500萬(wàn)U，每周3次，先靈葆雅）和拉米夫定（100 mg/d）聯(lián)合治療4周，然后再用α-2b干擾素（500萬(wàn)U，每周3次）單獨(dú)治療24周。B組患者每日接受100 mg的拉米夫定單獨(dú)治療持續(xù)48周。在48周治療結(jié)束后，所有患者均繼續(xù)治療24周。

1.2 YMDD突變的檢測(cè)

YMDD突變檢測(cè)采用我們所創(chuàng)建的一種基于Taqman技術(shù)的實(shí)時(shí)PCR，每隔12周進(jìn)行一次。在本研究中，我們?cè)O(shè)計(jì)了3個(gè)不同的反向引物，可以選擇性擴(kuò)增YMDD（野生型）、YVDD（rtM204V）和 YIDD（rtM204I）以及一個(gè)共同的位于HBV聚合酶基因高度保守序列上的正向引物，從而有效區(qū)別三種不同的病毒株。擴(kuò)增子通過(guò)一個(gè)設(shè)計(jì)在正向和反向引物之間與高度保守序列互補(bǔ)的Taqman探針在進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR過(guò)程中得到定量檢測(cè)。一個(gè)通用的正向引物被用于擴(kuò)增所有類(lèi)型的病毒株作為對(duì)照。擴(kuò)增體系先在50℃反應(yīng)2 min，然后95℃反應(yīng)5 min，然后是40個(gè)PCR循環(huán)：94℃反應(yīng)20 s，53℃反應(yīng)30 s。擴(kuò)增在ABI 7000儀器上進(jìn)行。

1.3 ALT水平、HBV標(biāo)志物和HBV-DNA檢測(cè)

ALT 水平 、HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe 和 anti-HBc采用商品試劑盒每隔30 d檢測(cè)1次。HBV-DNA水平的檢測(cè)采用復(fù)星診斷的試劑盒在ABI 7000儀器上進(jìn)行。所用試劑盒均經(jīng)過(guò)SFDA批準(zhǔn)用于臨床體外檢測(cè)。

1.4 療效評(píng)價(jià)

療效評(píng)價(jià)針對(duì)本研究中所有隨機(jī)招募的患者進(jìn)行。本研究中有兩項(xiàng)基本的評(píng)價(jià)指標(biāo)。一項(xiàng)是在72周時(shí)進(jìn)行，ALT水平的復(fù)常和HBV-DNA水平被抑制至低于1 000 copies/ml的患者比例。

第二項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)是在72周時(shí)測(cè)定患者中HBsAg消失或HBsAg血清轉(zhuǎn)換（定義為HBsAg的消失和anti-HBs的出現(xiàn)）的比例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

兩組間的差異性分析采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。顯著性水平設(shè)為 P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 生化應(yīng)答

在 24周后，A組 64例患者中血清 ALT復(fù)常 28例（44%），B組98例患者中72例（73%）復(fù)常。然而在48周后A組中38例（59%）復(fù)常，B組中只有54例（55%）保持了持續(xù)的生化應(yīng)答。在24周時(shí)B組中ALT水平復(fù)常的比例（73%）明顯高于 A 組（44%）（P＜0.05），而在 48 周時(shí)，兩組間沒(méi)有明顯區(qū)別。在72周時(shí)，A組中ALT水平復(fù)常的比例（53%）明顯高于 B 組（36%）。

2.2 病毒應(yīng)答

在24周時(shí)，A組HBV-DNA水平小于1 000 copies/ml的比例為81%，B組為78%；而在48周時(shí)，A組為56%，B組為55%。兩組在血清HBV-DNA抑制方面沒(méi)有明顯差異。在72周時(shí)，A組中HBV-DNA水平＜1 000 copies/ml的有9例（14%），B 組有 18例（18%），見(jiàn)表 2。

2.3 HBsAg應(yīng)答

在72周時(shí)，HBsAg消失或血清轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)兩組均未進(jìn)行檢測(cè)確定。

表2 治療24周、48周和72周時(shí)患者的病毒學(xué)和生化應(yīng)答[n(%)]

2.4 拉米夫定耐藥突變

沒(méi)有患者有證據(jù)表明在治療前發(fā)生了拉米夫定耐藥突變。所有的患者每隔12周進(jìn)行1次拉米夫定突變檢測(cè)。A組在24周時(shí)，只有2例患者發(fā)現(xiàn)有YIDD突變，在48周時(shí)沒(méi)有患者檢出YMDD突變。這2例發(fā)生YIDD突變的患者在48周和72周時(shí)ALT水平復(fù)常且HBV-DNA未檢出。相比之下，B組中在24周時(shí)有6例發(fā)生YMDD突變 （4例YIDD突變，2例YVDD突變）。48周時(shí)檢出22例患者發(fā)生突變（12例YIDD突變，8例YVDD突變，2例I/V混合突變）。所有的22例發(fā)生突變的患者在48周時(shí)都發(fā)生血清HBV-DNA的反彈，18例發(fā)生了ALT水平的反彈。

2.5 不良反應(yīng)

拉米夫定具有良好的耐受性且治療中未產(chǎn)生不良癥狀。在使用干擾素的過(guò)程中，6例患者有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，包括發(fā)熱、疲勞、肌痛和頭痛。本研究中未發(fā)現(xiàn)有抑郁癥狀的患者。治療過(guò)程中，中性粒細(xì)胞和血小板數(shù)量下降，但是在治療結(jié)束后很快又恢復(fù)到基準(zhǔn)水平。所有患者都完成了全部治療過(guò)程。

3 討論

慢性乙肝患者單獨(dú)用α-干擾素治療的長(zhǎng)期效果不佳，很可能是由于早期機(jī)體感染的乙肝病毒所誘導(dǎo)出的對(duì)HBV的免疫耐受所致[7-8]。用拉米夫定和α-干擾素序貫治療對(duì)于單獨(dú)用干擾素?zé)o應(yīng)答的慢性乙肝患者較為有效，主要原因可能是拉米夫定誘導(dǎo)的T細(xì)胞對(duì)HBV清除活性的恢復(fù)和HBV-DNA水平的降低，從而提高了α-干擾素的治療功效[9-10]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)于HBeAg陰性患者采用先用拉米夫定后用α-干擾素序貫治療可以使其產(chǎn)生有效應(yīng)答，而且在治療中拉米夫定耐藥突變能得以有效抑制。在治療結(jié)束時(shí)，序貫治療的64例患者未發(fā)現(xiàn)YMDD突變，而拉米夫定單獨(dú)治療的98例患者中有22例產(chǎn)生YMDD變異。

拉米夫定長(zhǎng)期用藥會(huì)誘導(dǎo)YMDD變異的產(chǎn)生，有時(shí)還伴隨著嚴(yán)重的肝炎癥狀。以往的研究表明，拉米夫定和α-干擾素序貫治療能誘導(dǎo)α-干擾素單獨(dú)用藥無(wú)應(yīng)答者產(chǎn)生持續(xù)的病毒應(yīng)答，同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生拉米夫定耐藥突變選擇[11-12]。二者聯(lián)合用藥以及序貫治療非常有效，而且能夠延遲拉米夫定耐藥突變選擇。最近的研究表明一種針對(duì)年輕乙肝患者的分三個(gè)階段的拉米夫定和α-干擾素序貫治療能夠降低HBVDNA水平，但是不能阻止拉米夫定耐藥突變的產(chǎn)生。在我們的研究中，接受拉米夫定和干擾素序貫治療的患者中56%在治療結(jié)束時(shí)血清HBV-DNA轉(zhuǎn)陰。拉米夫定單獨(dú)治療的患者中55%轉(zhuǎn)陰。序貫治療小組中未發(fā)現(xiàn)有拉米夫定變異，拉米夫定單獨(dú)治療組中有22.45%的患者發(fā)生YMDD變異。這些發(fā)現(xiàn)與以往的聯(lián)合用藥治療研究結(jié)果相一致。序貫治療看起來(lái)更加有效，并且能抑制拉米夫定耐藥突變的產(chǎn)生。

2例患者在序貫治療24周時(shí)發(fā)生YIDD突變，但是在48周和72周時(shí)，ALT水平復(fù)常且血清HBV-DNA未檢出。變異在拉米夫定治療12～24周時(shí)產(chǎn)生，在換用α-干擾素治療后消失。這表明α-干擾素可能對(duì)于一些拉米夫定變異患者是有效的。

在24周時(shí)，A組的ALT水平比B組高，這可能是由于添加用藥α-干擾素引起了21例患者的ALT水平升高。在這21例患者中，6例在72周時(shí)表現(xiàn)出持續(xù)的生化和病毒應(yīng)答。筆者不能下結(jié)論說(shuō)在α-干擾素治療開(kāi)始時(shí)ALT水平的升高延長(zhǎng)了應(yīng)答期。然而在72周時(shí)序貫治療組產(chǎn)生了更高的生化應(yīng)答率。這可能是由于α-干擾素對(duì)于血清ALT水平復(fù)常起了重要作用。

本研究的主要不足在于缺少組織學(xué)應(yīng)答的數(shù)據(jù)。在其他研究中，有較長(zhǎng)病毒應(yīng)答的患者會(huì)有組織學(xué)上的明顯改善。在組織學(xué)活性改善與延長(zhǎng)的生化和病毒應(yīng)答之間有著較強(qiáng)的聯(lián)系。B組中男性比例比A組高，這可能引起治療功效評(píng)價(jià)的一些偏差，而且，本研究中持續(xù)應(yīng)答率較低是由于治療時(shí)間相對(duì)較短。以后的研究中需要對(duì)更長(zhǎng)時(shí)間的治療進(jìn)行評(píng)估。

與聯(lián)合治療相比，序貫治療更加經(jīng)濟(jì)。在中國(guó)，α-干擾素較為便宜，24周的治療大約花費(fèi)3 000元，而48周的拉米夫定治療大約花費(fèi)6 000元。中國(guó)是世界上的乙肝大國(guó)，由于收入有限，大多數(shù)中國(guó)人將從廉價(jià)的治療方案中受益。到目前為止，中國(guó)藥監(jiān)局已經(jīng)批準(zhǔn)了5種用于慢性乙肝治療的藥物，分別是α-干擾素、拉米夫定、阿德福韋、PEGα-2a-干擾素和恩替卡韋。這些藥物在藥品管理、有效期、治療功效、耐藥性和治療成本方面都存在很大不同[4,13]。雖然恩替卡韋在不存在拉米夫定耐藥突變時(shí)有很好的療效，拉米夫定由于其價(jià)格低廉在中國(guó)仍然會(huì)被保留下來(lái)用于治療。我們的結(jié)果表明拉米夫定和α-干擾素對(duì)于HBeAg陰性患者的序貫治療與拉米夫定單獨(dú)治療同樣有效，而且能夠有效抑制YMDD突變的產(chǎn)生。對(duì)于慢性乙肝序貫治療的時(shí)機(jī)和管理以及不同藥物的采用仍需做進(jìn)一步的研究。

[1]Lee W.Hepatitis B virus infection [J].N Engl J Med,1997,337(45):1733-1745.

[2]Beasley RP.Hepatitis B virus:the major etiology of heap tocellular carcinoma[J].Cancer,1988,61(10):1942-1956.

[3]Yuen MF,Lai CL.Treatment of chronic hepatitis B [J].Lancet Infect Dis,2001,11(3):232-241.

[4]Marcellin P,Lau GK,Bonino F,et al.Peginterferon alfa-2a alone,lamivudine alone,and the two in combination in patients with HBeAgnegative chronic hepatitis B[J].N Engl JMed,2004,351:1206-1217.

[5]Averett DR,Masson WS.Evaluation of drugs for antiviral activity against hepatitis B virus[J].Viral Hepat Rev,1995,12(3):129-142.

[6]Wong DK,Cheung AM,O′Rourke K,et al.Effect of alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B e ntigenpositive chronic hepatitis B.A meta-analysis[J].Ann Intern Med,1993,119(33):312-323.

[7]Lok AS,Chung HT,Liu VW,et al.Long-term follow-up of chronic hepatitis B patients treated with interferon alfa [J].Gastroenterology,1993,105(234):1833-1838.

[8]Lok AS,Lai CL,Wu PC,et al.Treatment of chronic hepatitis B with interferon:experience in Asian patients [J].Semin Liver Dis,1989,9(26):249-253.

[9]Serfaty L,Thabut D,Zoulim F.et al.Sequential treatment with lamivudine and interferon monotherapies in patients with chronic hepatitis B not responding to interferon alone:results of a pilot study[J].Hepatology,2001,34(26):573-577.

[10]Boni C,Bertoletti A,Penna A,et al.Lamivudine treatment can restore T cell responsiveness in chronic hepatitis B[J].JClin Invest,1998,102(362):968-975.

[11]Lai CL,Dienstag J,Sshiff E.Prevalence and clinical correlates ofYMDD variants during lamivudine therapy for patients with chronic hepatitis B[J].Clin Infect Dis,2003,36(6):687-696.

[12]Liaw YF,Chien RN,Yeh CT,et al.Acute exacerbation and hepatitis B virus clearance after emergence of YMDD motif mutation during lamivudine therapy[J].Hepatology,1999,30(2):579-581.

[13]Lau GK,Piratvisuth T,Luo KX,et al.Peginterferon alfa-2a,lamivudine,and the combination for HBeAg-positive chronic hepatitis B[J].N Engl JMed,2005,352:2682-2695.