孫曉偉，于學平，滕偉，王冠

(黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

腦血管疾病是嚴重危害人類生命的三大疾病之一，其中缺血性腦血管疾病的發(fā)病率約占75%［1］。中醫(yī)學將其歸屬于“中風”范疇。針刺作為缺血性腦血管疾病的非藥物療法之一，不僅被公認可用于恢復期治療，而且已被越來越普遍地應用于急性期的輔助治療，尤其在超早期采用針刺干預治療更有意義［2－4］。本實驗以大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血2h再灌注為模型，觀察頭針對急性腦缺血再灌注大鼠行為學評分、腦梗死體積和皮層神經(jīng)元損傷的影響，為臨床應用該療法提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級健康雄性SD大鼠140只，體質(zhì)量280～300g。隨機分為3組:假手術組30只，模型組和針刺組各55只。其中30只用于神經(jīng)功能評分和TTC染色;另外25只用于HE染色測定。各組再根據(jù)缺血2h再灌注后的時間不同分為 IR4h、IR12h、IR24h、IR48h、IR72h五個亞組。

1.2 動物造模及篩選成功模型

采用改良的Zea Longa線栓法［5］復制大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血2h再灌注模型。術后大鼠出現(xiàn)左側(cè)肢體癱瘓，提尾懸空出現(xiàn)左上肢屈曲，或行進時向左側(cè)傾斜、轉(zhuǎn)圈，提示造模成功。假手術組大鼠在進行插栓時，僅將線拴插入12mm，不阻斷大腦中動脈血流。

1.3 實驗動物的干預方法

頭針組大鼠在造模2h動物清醒后給予頭針治療，每12h針刺1次。參照《實驗動物穴位圖譜》取患側(cè)百會穴透曲鬢穴，進針約0.8寸，留針30min，期間捻轉(zhuǎn)3次，每次5min，速度200r/min。假手術組和模型組大鼠造模后，每天在治療時間不作治療，但均要抓取并固定1次(30min/次)，以保證和針刺組的大鼠飼養(yǎng)條件相同。

1.4 指標測定

參照Belayev等［6］提出的12分評分法進行神經(jīng)功能評分測定;采用TTC染色法測定腦梗死體積，HE染色法觀察皮層神經(jīng)元損傷情況。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。兩組數(shù)據(jù)間比較使用單因素方差分析(One－way ANOVA)，多組數(shù)據(jù)間比較使用S－N－K及LSD檢驗。P＜0.05說明統(tǒng)計學差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 不同時間點各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較結(jié)果見表1。

2.2 不同時間點各組大鼠相對腦梗死體積比較 結(jié)果見表2、圖1～2。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較(±s)

注:與同時間點假手術組比較，△P＜0.05;與同時間點模型組比較，★P＜0.05。

假手術組15 0 0 0 0 0模型組 30 7.50 ±0.84△ 8.17 ±0.75△ 10.50 ±1.05△ 9.67 ±0.52△ 7.67 ±0.52△頭針組 30 7.33 ±0.82△ 8.00 ±0.63△ 9.33 ±0.82△ 8.83 ±0.75△★ 6.83 ±0.75△★

表2 各組大鼠相對腦梗死體積比較(±s，%)

表2 各組大鼠相對腦梗死體積比較(±s，%)

注:與同時間點假手術組比較，△P＜0.05;與同時間點模型組比較，★P＜0.05。

假手術組15 0 0 0 0 0模型組 30 8.17 ±1.48△ 15.32 ±3.15△ 39.49 ±3.94△ 36.55 ±3.32△ 34.04 ±3.30△頭針組 30 7.25 ±1.50△ 13.58 ±2.85△ 34.88 ±3.04△★ 29.87 ±3.54△★ 26.53 ±3.16△★

圖1 模型組與假手術組大鼠腦缺血再灌注后不同時間點TTC染色注:圖中箭頭所指處為梗死灶(腦組織呈蒼白色)。

圖2 頭針組與假手術組大鼠腦缺血再灌注后不同時間點TTC染色注:圖中箭頭所指處為梗死灶(腦組織呈蒼白色)。

2.3 不同時間點各組大鼠皮層神經(jīng)元損傷結(jié)果

假手術組:皮層各層神經(jīng)細胞密集，分層整齊排列。神經(jīng)元形態(tài)完整，細胞核呈藍紫色，胞漿呈粉紅色，胞核居中，核仁清晰，周圍間隙無水腫，無炎性細胞浸潤，也無梗死灶出現(xiàn)。模型組:再灌注4h缺血區(qū)內(nèi)即可見較多腫脹、皺縮的神經(jīng)元，呈桿狀或三角形外觀的急性型改變，部分神經(jīng)元胞漿腫脹，胞核增大，但核膜邊界清晰，細胞周圍出現(xiàn)間隙，部分區(qū)域出現(xiàn)點狀壞死。再灌注12～24h，可見細胞周圍間隙增大更加明顯，紅神經(jīng)元和鬼影細胞逐漸增多，缺血梗死區(qū)面積增大，光鏡下呈現(xiàn)神經(jīng)組織完全破壞，神經(jīng)元核固縮、深染，核仁、異染色質(zhì)消失，胞質(zhì)少、著色深，胞體呈桿形或梭形;膠質(zhì)細胞和微血管內(nèi)皮細胞壞死并出現(xiàn)很多細胞死亡留下的空泡，血管周圍可見炎性細胞浸潤;神經(jīng)纖維成海綿狀或空泡狀。再灌注48～72h，梗死區(qū)面積已趨于穩(wěn)定，可見大量壞死細胞，核膜崩解、核仁消失，炎性細胞及膠質(zhì)浸潤明顯增多。頭針組:再灌注4h，大鼠腦組織損傷的表現(xiàn)與模型組相似;再灌注12h、24h，與模型組相比，細胞周圍間隙有所減小，未見大量空泡，少量炎性細胞聚集;再灌注48～72h較模型組減輕最明顯，皮層各層神經(jīng)細胞損傷密度顯著下降，神經(jīng)元丟失減少，間質(zhì)水腫及神經(jīng)細胞腫脹減輕，可見少量神經(jīng)元固縮深染。

3 討論

腦血管病的發(fā)病率占各種老年疾病的前3位，其中以缺血性腦血管病居多，并有逐漸上升和年輕化的趨勢，嚴重危害著人類的健康和患者的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)的“非藥物”治療方法－針刺，具有“整體良性調(diào)整作用”，對機體可發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多水平、多途徑的調(diào)節(jié)作用。一些研究也證實了早期針刺可加速腦側(cè)支循環(huán)的建立，增加腦血流量，改善腦的氧代謝，保護神經(jīng)元，減少腦神經(jīng)元的凋亡。神經(jīng)功能評分的行為學檢查是評價缺血性腦損害重要的指標之一，也是評價腦組織功能恢復的有效方法;而腦梗死體積是評價缺血性腦損害的重要的客觀指標之一，也是觀察療效的最可靠指標。

本實驗研究結(jié)果顯示，假手術組大鼠手術完成后，表現(xiàn)正常，無神經(jīng)缺損體征出現(xiàn)和梗死灶形成，皮層神經(jīng)元形態(tài)完整。模型組和頭針組大鼠，在腦缺血再灌注后不同時間點均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損和大小不同的梗死灶，與假手術組比較均具有顯著性差異(P＜0.05);且皮層神經(jīng)元均出現(xiàn)了不同程度的急性型損傷改變和遲發(fā)型損傷改變，說明模型復制成功。模型組大鼠在大腦中動脈缺血2h再灌注后，呈現(xiàn)出腦梗塞發(fā)展過程:在再灌注4h，紋狀體區(qū)開始出現(xiàn)梗死，但梗死體積很小;隨后梗死迅速發(fā)展，皮層的外側(cè)區(qū)也出現(xiàn)梗死;再灌注24～48h相對腦梗死體積擴展至最大，梗死側(cè)可見大腦半球背外側(cè)面大部分包括頂顳皮質(zhì)、尾殼核的中外側(cè)以及內(nèi)側(cè)部的顏色均成蒼白色;隨后相對梗死體積趨于穩(wěn)定。這一變化規(guī)律與大鼠的神經(jīng)功能評分的動態(tài)變化一致:即模型組大鼠在再灌注4h即出現(xiàn)較明顯神經(jīng)功能缺損，且隨著再灌注時間的延長逐漸加重，以再灌注24～48h神經(jīng)功能缺損最為嚴重;其后神經(jīng)功能缺損逐漸減輕。說明神經(jīng)功能缺損評分與腦梗死體積之間顯著相關。與模型組比較，頭針組大鼠在再灌注各時間點相對腦梗死體積和神經(jīng)功能缺損評分均有所降低，但隨著針刺治療時間及次數(shù)的增加，再灌注24h、48h、72h相對腦梗死體積下降最為明顯，與同期模型組相比，具有統(tǒng)計性差異(P＜0.05);在再灌注48h、72h神經(jīng)功能缺損評分較同期模型組明顯減低，具有顯著性差異(P＜0.05)。此研究結(jié)果表明，隨著針刺次數(shù)的增加和治療時間的延長，頭針可明顯改善大鼠的神經(jīng)功能缺損、縮小腦梗死體積。

模型組大鼠在再灌注4h，皮層可見較多腫脹、皺縮的神經(jīng)元，呈桿狀或三角形外觀的急性型改變;再灌注12～24h，可見紅神經(jīng)元和鬼影細胞逐漸增多，神經(jīng)元核固縮、深染，核仁、異染色質(zhì)消失，胞體呈桿形或梭形;再灌注48～72h，可見大量壞死神經(jīng)元，核膜崩解、核仁消失。頭針組大鼠在再灌注4h、12h、24h，大鼠皮層神經(jīng)元損傷的表現(xiàn)與模型組相似;再灌注48～72h較模型組明顯減輕，皮層各層神經(jīng)細胞損傷密度顯著下降，神經(jīng)元丟失減少，間質(zhì)水腫及神經(jīng)細胞腫脹減輕，僅見少量神經(jīng)元固縮深染。此研究結(jié)果表明隨著針刺時間的延長和針刺次數(shù)的增加，頭針能顯著減輕皮層神經(jīng)細胞和膠質(zhì)細胞腫脹，促進間質(zhì)水腫的消退，加速皮層損傷神經(jīng)元的修復。

綜合上述實驗結(jié)果不難發(fā)現(xiàn)，隨著針刺次數(shù)的增加和治療時間的延長，頭針可以明顯減小腦梗死體積、減輕大鼠的神經(jīng)功能缺損程度和皮層神經(jīng)元的缺血損傷，對腦缺血再灌注大鼠具有明顯的神經(jīng)保護作用。但其具體的保護機制，還有待于今后進一步研究。

［1］董瑞國，王國良.卒中的流行病學研究和預防［J］.國外醫(yī)學·腦血管疾病分冊，1995，3(3):115.

［2］孫曉偉，鄒偉，于學平，等.頭針對局灶性腦缺血再灌注模型大鼠治療時間窗研究［J］.中醫(yī)藥信息，2009，26(2):66－68.

［3］孫曉偉，于學平，李洪濤，等.頭針對腦缺血再灌注大鼠腦組織MMP－9表達調(diào)控的動態(tài)研究［J］.中醫(yī)藥學報，2011，39(3):107－111.

［4］李丹，鄒偉，王瓏，等.針刺對實驗性腦出血急性期大鼠腦組織Nestin表達的影響［J］.中醫(yī)藥學報，2010，38(2):60－62.

［5］吳浩，吉訓明，趙喜慶，等.改良大鼠大腦中動脈阻塞模型的建立［J］.中國腦血管病雜志，2006，12(3):550－553.

［6］Belayev L，Alonso OF，Busto R，et al.Middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture［J］.Stroke，1996，27(9):1616－23.