李洪濤，高曦，王樹(shù)人，王波

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

糖皮質(zhì)激素在世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，激素性股骨頭壞死是其嚴(yán)重的并發(fā)癥，也是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，病人絕大多數(shù)為青壯年，且病情頑固。該病的發(fā)病機(jī)理目前還不是十分清楚，因此對(duì)該病的病理機(jī)制和發(fā)病過(guò)程的研究意義重大。在早期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的同時(shí)，針對(duì)其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)早期干預(yù)能減少激素性股骨頭壞死的發(fā)生。糖皮質(zhì)激素主要和糖皮質(zhì)激素受體α(GR－α)結(jié)合，發(fā)揮其生理及藥理功能，糖皮質(zhì)激素受體α的密度及親和力與糖皮質(zhì)激素的作用成正相關(guān)。所以在激素性股骨頭壞死早期檢測(cè)在股骨頭局部GR－α mRNA的變化，探討其發(fā)病機(jī)制，有助于我們尋找早期進(jìn)行防治的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用純種健康54只雄性成年日本大耳白兔，體質(zhì)量(3.0±0.2)kg(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，所有動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，通風(fēng)，自由飲水進(jìn)食，普通草料喂養(yǎng))。

1.2 主要儀器及藥品試劑

馬血清(HyClone公司);甲強(qiáng)龍(注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉，Pfizer生產(chǎn));骨蝕靈膠囊(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院制藥廠);引物(上海超世生物科技有限公司合成);TRIzol Reagent(Invitrogen公司);DEPC(Sigma公司);RT－PCR試劑盒(Promega公司);寶生物rTaq酶及配套試劑;ABI 9700型PCR擴(kuò)增儀;臺(tái)式低溫高速離心機(jī)(Heraeus instruments，德國(guó));穩(wěn)壓穩(wěn)流定時(shí)電泳儀(BIO－RAD，美國(guó));水平電泳槽(BIO－RAD，美國(guó));紫外分光光度計(jì)(BIO－RAD，美國(guó))。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

54只日本大耳白兔適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后，精確稱(chēng)重，以隨機(jī)數(shù)字表法將兔子隨機(jī)分為3組。Ⅰ組:空白對(duì)照組，12只。Ⅱ組:模型組，Ⅲ組:治療組。Ⅱ、Ⅲ兩組共42只，兩次馬血清注射過(guò)程中死亡6只，兩次血清注射后再將注射馬血清的家兔隨機(jī)分配至Ⅱ、Ⅲ組中，每組18只，三組動(dòng)物體重經(jīng)t檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

Ⅰ組:空白對(duì)照組(簡(jiǎn)稱(chēng)空白組)12只;Ⅱ組:糖皮質(zhì)激素組(簡(jiǎn)稱(chēng)模型組)18只;Ⅲ組:骨蝕靈組(簡(jiǎn)稱(chēng)治療組)18只。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立及處理措施

模型組和治療組每只第1次經(jīng)耳緣靜脈注射馬血清10mL/kg，間隔3周。第2次按6mL/kg劑量再注射馬血清1次，間隔2周，然后分別按45mg/kg連續(xù)3天，腹腔注射甲強(qiáng)龍3次，注射激素期間各組家兔均臀肌注射青霉素8萬(wàn)u/只抗感染。空白組與模型組和治療組于相同時(shí)間點(diǎn)于耳緣靜脈和臀肌注射等量生理鹽水作為對(duì)照，激素注射4周、8周后分別處死全部動(dòng)物。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)體重動(dòng)物的公斤體重劑量換算公式［1］，換算人－兔的生藥量。于激素注射結(jié)束后第2天開(kāi)始，按人與兔體表面積換算出的用藥量開(kāi)始灌胃給藥?？瞻捉M和模型組應(yīng)用蒸餾水進(jìn)行空腹灌胃，20mL/2d。治療組給予骨蝕靈膠囊粉末8.16g/kg，相當(dāng)于生藥2.04g/kg，用蒸餾水調(diào)成混懸液20mL，空腹灌胃給藥，1次/2日。

2 數(shù)據(jù)收集及統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 11.5對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，各組數(shù)據(jù)組間比較使用one－way ANOVA方法統(tǒng)計(jì)，兩組均數(shù)之間的比較應(yīng)用t檢驗(yàn)，多個(gè)均數(shù)之間的比較應(yīng)用S－N－K檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用 χ2檢驗(yàn)(Chi－square test)，P＜0.05表示差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 引物

3.2 β－actin表達(dá)

3.2.1 4周β－actin表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 4周β－actin表達(dá)

3.2.2 8周β－actin表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 8周β－actin表達(dá)

3.3 GR－α mRNA的表達(dá)

3.3.1 4周GR－α mRNA的表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖3，表1。

圖3 4周GR－α mRNA表達(dá)

3.3.2 8周GR－α mRNA的表達(dá) 結(jié)果見(jiàn)圖4，表1。

圖4 8周GR－α mRNA表達(dá)

表1 4周、8周GR－α mRNA樣本表達(dá)量(±s)

表1 4周、8周GR－α mRNA樣本表達(dá)量(±s)

注:與空白組比較，★P＜0.05;與治療組比較，▲P＜0.05。

4 周 0.2061 ±0.0136 0.3626 ±0.0254★ 0.4236 ±0.0212★▲8 周 0.1615 ±0.0737 0.4051 ±0.0259★ 0.4514 ±0.0262★▲

4 討論

糖皮質(zhì)激素具有多種強(qiáng)大的作用，其作用通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)。作為配體依賴(lài)性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，GR與糖皮質(zhì)激素結(jié)合后，能轉(zhuǎn)入核內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，產(chǎn)生各種效應(yīng)。應(yīng)用激素后可以造成血液的高凝狀態(tài)，導(dǎo)致在股骨頭局部的低氧環(huán)境。所以GR在激素性股骨頭壞死的病程中具有重要作用，而GR－α又是主要的作用受體，因而通過(guò)研究在股骨頭局部特定低氧環(huán)境下糖皮質(zhì)激素和GR－α的相互關(guān)系的變化至關(guān)重要。在微觀局部環(huán)境下，低氧和糖皮質(zhì)激素受體關(guān)系密切，低氧可以造成糖皮質(zhì)激素受體的上調(diào)，并產(chǎn)生一種糖皮質(zhì)激素依賴(lài)的傾向。將糖皮質(zhì)激素受體減少后，在低氧中糖皮質(zhì)激素的作用被減弱。將低氧誘導(dǎo)因子－1α過(guò)表達(dá)，可造成糖皮質(zhì)激素受體的上調(diào)，并增強(qiáng)糖皮質(zhì)激素依賴(lài)的活性。由此可見(jiàn)，低氧環(huán)境可引起糖皮質(zhì)激素受體的上調(diào)，從而增加糖皮質(zhì)激素的敏感性，這不僅是一種糖皮質(zhì)激素依賴(lài)反應(yīng)的調(diào)節(jié)，還是一種低氧依賴(lài)反應(yīng)和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用半定量RT－PCR法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)GR－α mRNA表達(dá)，GR－α mRNA的表達(dá)隨著時(shí)間推移各組表達(dá)量逐漸升高，進(jìn)一步增強(qiáng)了糖皮質(zhì)激素對(duì)股骨頭局部的作用。近年來(lái)，中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)GR的研究上取得了可喜的成績(jī)，中藥和糖皮質(zhì)激素合用能夠發(fā)揮糖皮質(zhì)激素的重要作用，同時(shí)能降低GC的不良反應(yīng)［1］，發(fā)揮中醫(yī)“治未病”的優(yōu)勢(shì)，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

［1］康天濟(jì)，蔣愛(ài)麗.補(bǔ)腎實(shí)骨湯治療糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2009，37(4):32－35.