韓小冰，謝孝坤，喬潤(rùn)喜

（1.黑河市森林病蟲(chóng)防治檢疫站，黑龍江 黑河 164300；2.黑河市愛(ài)輝區(qū)森林病蟲(chóng)防治檢疫站）

菊科植物種類多、分布廣、化學(xué)成分多且復(fù)雜，幾乎含有所有的生物活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)利用菊科植物資源具有重要意義[1]。蒿屬在黑龍江省有50多種，目前研究比較深入的有豬毛蒿、黃花蒿等少數(shù)幾個(gè)種，有必要探索蒿屬植物其他種的殺蟲(chóng)效果，而不同提取方法和不同溶劑提取液殺蟲(chóng)效果的研究是開(kāi)發(fā)利用蒿屬植物的基礎(chǔ)性步驟之一。

本文通過(guò)不同提取方法、不同提取溶劑對(duì)5種蒿屬植物的殺蟲(chóng)有效物質(zhì)進(jìn)行提取，并對(duì)林業(yè)上危害比較大的舞毒蛾進(jìn)行了初步毒力測(cè)定、觸殺毒力測(cè)定、胃毒毒力測(cè)定、拒食活性測(cè)定，初步了解這5種蒿屬植物對(duì)舞毒蛾的作用方式，并得到較好的提取方法和提取溶劑，為實(shí)際應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

舞毒蛾 （LymantriadisparL.）[2]：鱗翅目毒蛾科。分布于東北、華北、華東、西北、華中、西南、東南沿海；日本、朝鮮、歐洲、美洲。為世界性林木大害蟲(chóng)，能取食500余種植物，以櫟、楊、柳、榆、樺、槭、油松、云杉、柳杉、柿及薔薇果樹(shù)受害重。試驗(yàn)用蟲(chóng)采自沾河林業(yè)局，試驗(yàn)時(shí)挑選3齡幼蟲(chóng)供試。

1.2 供試植物

黃花蒿（Artemisiaannua）

大籽蒿（Artemisiasieversiana）

蒙古蒿（Artemisiamogolica）

豬毛蒿（Artemisiascoparia）

野艾蒿（Artemisialavandulaefolia）

以上植物均采自東北林業(yè)大學(xué)試驗(yàn)林場(chǎng)。將采集的植物于50℃下烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，放棕色瓶中備用。

1.3 試劑和主要儀器

試劑：乙醇、石油醚、丙酮、三氯甲烷。以上都是分析純。

主要儀器：IKA-ALL basic分析型研磨機(jī)，AS20500A型超聲波清洗器，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，索氏提取器，DK-S26電熱恒溫水浴鍋，SHB-2000型循環(huán)水真空泵。

1.4 提取方法

索氏法提?。簻?zhǔn)確稱取植物干物質(zhì)10g，用濾紙包好放于索氏提取器中，加入100mL濃度為90%的乙醇。連續(xù)回流提取6h，待水浴鍋的水冷卻后，取出濾紙包，將里面的藥液充分?jǐn)D出，然后把混合液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮至稠膏狀，配置成濃度為10mg／mL的丙酮溶液，存于4℃的冰箱備用。

超聲波提?。簻?zhǔn)確稱取植物干物質(zhì)20g，放入500mL的錐形瓶中，分別加入200mL丙酮、90%的乙醇、三氯甲烷、石油醚，然后放到超聲波提取器上震蕩40min，之后過(guò)濾，將濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮至稠膏狀，配置成濃度為10mg／mL的丙酮溶液，存于4℃的冰箱備用。

冷浸提?。簻?zhǔn)確稱取植物干物質(zhì)20g，放入500mL的錐形瓶中，加入200mL濃度為90%的乙醇，封口，放在避光處浸泡，期間不時(shí)攪拌，4d后抽濾，殘?jiān)偌尤胪康娜軇├^續(xù)浸泡，反復(fù)3次，合并濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮至稠膏狀，配置成濃度為10mg／mL的丙酮溶液，存于4℃的冰箱備用。

2 生測(cè)方法

2.1 初步毒力測(cè)定

采用常量噴霧法，測(cè)試提取液（索氏提取法、超聲波提取法、冷浸提取法都用90%乙醇對(duì)5種植物進(jìn)行提取）對(duì)舞毒蛾的綜合作用（胃毒、觸殺及拒食）[3]，將試驗(yàn)用蟲(chóng)和帶葉枝條一同處理，每個(gè)養(yǎng)蟲(chóng)籠投入的帶葉枝條帶葉量大致相同，噴霧時(shí)以霧滴均勻分布在葉面并且藥液不下滴為準(zhǔn)。把經(jīng)過(guò)處理的枝條和試蟲(chóng)一起放進(jìn)養(yǎng)蟲(chóng)籠中，為保證處理過(guò)的枝條不發(fā)生萎蔫，采用水培法進(jìn)行保濕飼養(yǎng)，并且要保證養(yǎng)蟲(chóng)籠有充足的陽(yáng)光照射。每個(gè)處理30頭試蟲(chóng)，用清水作為對(duì)照。處理72h后，檢查供試蟲(chóng)的死亡率、校正死亡率，并目測(cè)拒食情況。

2.2 觸殺活性試驗(yàn)

采用點(diǎn)滴法，選取發(fā)育整齊一致的3齡幼蟲(chóng)，用微量點(diǎn)滴器點(diǎn)10μL濃度為10、5、1mg／mL的藥液于3齡幼蟲(chóng)的前胸背板，設(shè)丙酮溶劑為對(duì)照。處理后的舞毒蛾幼蟲(chóng)置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，喂以新鮮的榆樹(shù)葉。重復(fù)3次，每次重復(fù)用10頭幼蟲(chóng)，處理72h后，檢查供試蟲(chóng)的死亡率、校正死亡率。

2.3 胃毒活性試驗(yàn)

采用載毒葉碟飼喂法。榆樹(shù)葉在處理液（濃度為10、5、1mg／mL）中浸泡約3～4s，取出后讓溶劑揮發(fā)干，然后放入墊有濾紙的9cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接入1頭饑餓4h的3齡幼蟲(chóng)，放入試驗(yàn)室中飼養(yǎng)，設(shè)丙酮溶劑為對(duì)照。每個(gè)處理10頭幼蟲(chóng)，重復(fù)3次，處理72h后，檢查供試蟲(chóng)的死亡率、校正死亡率。

2.4 非選擇性拒食試驗(yàn)

采用小葉碟添加法。將新鮮的榆樹(shù)葉片用圓形打孔器打成直徑為2cm的葉碟若干，在濃度為10mg／mL的藥液中浸泡3～4s，取出后讓溶劑揮發(fā)干，然后放入墊有濾紙的9cm的培養(yǎng)皿中，每皿放入4片榆樹(shù)葉片，上面覆一塊紗布，在每個(gè)培養(yǎng)皿中心點(diǎn)接入已饑餓4h的3齡幼蟲(chóng)1頭。放入試驗(yàn)室飼養(yǎng)，試蟲(chóng)取食24h后，取出殘余的葉碟，添加4片新的藥液處理過(guò)的葉碟。每個(gè)處理10頭幼蟲(chóng)，重復(fù)3次，用丙酮溶劑作為對(duì)照，處理24h、48h后用方格紙測(cè)定試蟲(chóng)取食葉片面積，計(jì)算拒食率。

2.5 數(shù)據(jù)處理

死亡率／%＝（試蟲(chóng)死亡數(shù)÷試蟲(chóng)總數(shù)）×100%校正死亡率／%＝（處理組死亡率／%－對(duì)照組死亡率／%）÷（100－對(duì)照組死亡率／%）×100%

拒食率／%＝[（對(duì)照組取食葉面積／%－處理組取食葉面積／%）÷對(duì)照組取食葉面積／%]×100%

葉片分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：零級(jí)；無(wú)取食痕跡；Ⅰ級(jí)：零星取食；Ⅱ級(jí)：有明顯取食缺刻；Ⅲ級(jí)；取食量約占總?cè)~量的1／3；Ⅳ級(jí)；取食量約占總?cè)~量的1／2；Ⅴ級(jí)；葉片僅剩下少量殘?jiān)?/p>

3 結(jié)果與分析

3.1 提取方法對(duì)比

試驗(yàn)采用索氏提取法、超聲波提取法、冷浸提取法提取植物體內(nèi)殺蟲(chóng)有效物質(zhì)，3種提取方法的提取溶劑都選用90%乙醇。將粗提液配制成10mg／mL的丙酮溶液。用常量噴霧法處理舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)，測(cè)定結(jié)果（72h校正死亡率%）見(jiàn)表1。

表1

圖1 不同提取方法粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)毒力測(cè)定對(duì)比圖

由圖1可見(jiàn)，提取方法中超聲波提取法代表的曲線位于索氏提取法和冷浸提取法代表的曲線之上，說(shuō)明3種提取方法中超聲波提取法提取的活性物質(zhì)殺蟲(chóng)效果要好于索氏提取法和冷浸提取法，并且在超聲波提取法代表的曲線上大籽蒿和黃花蒿的位點(diǎn)較高，校正死亡率高于60%。由表1可見(jiàn)，大籽蒿超聲波提取法提取的粗提液對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)的校正死亡率為76.67%，黃花蒿為66.67%；豬毛蒿和蒙古蒿次之，豬毛蒿超聲波提取法提取的粗提液對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)的校正死亡率為53.33%，蒙古蒿低于50%；野艾蒿最差，野艾蒿3種提取方法提取的粗提液對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)的校正死亡率都低于50%，殺蟲(chóng)效果不理想。下一步選用超聲波提取法對(duì)5種蒿屬植物進(jìn)行觸殺和胃毒試驗(yàn)。采用目測(cè)法測(cè)定3種提取方法提取的粗提液的拒食效果。拒食情況見(jiàn)表2。

表2 不同提取方法粗提液對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)的拒食效果

由表2可見(jiàn)，5種蒿屬植物用冷浸提取法提取的粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)的拒食效果從總體上來(lái)看要好于索氏提取法和冷浸提取法，所以下一步的拒食試驗(yàn)采用冷浸提取法。

3.2 觸殺試驗(yàn)

將5種蒿屬植物不同溶劑粗提物配置成濃度為10、5、1mg／mL的丙酮溶液。用點(diǎn)滴法處理舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)，72h校正死亡率（%）見(jiàn)表3。

表3

由表3可見(jiàn)，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)，校正死亡率隨著粗提液濃度的加大而升高。

由試驗(yàn)結(jié)果還可以看出：同一植物不同溶劑提取的粗提物的殺蟲(chóng)活性不同。濃度為10mg／mL時(shí)，蒙古蒿4種提取溶劑中丙酮粗提物對(duì)舞毒蛾的校正死亡率最高，其次為乙醇，再次為三氯甲烷和石油醚；大籽蒿4種溶劑粗提物對(duì)舞毒蛾的校正死亡率從大到小依次為三氯甲烷＞乙醇＞石油醚＞丙酮；黃花蒿4種溶劑粗提物對(duì)舞毒蛾的校正死亡率從大到小依次為乙醇＞三氯甲烷＞石油醚＞丙酮；豬毛蒿4種溶劑粗提物對(duì)舞毒蛾的校正死亡率從大到小依次為石油醚＞丙酮＞三氯甲烷＞乙醇；野艾蒿4種溶劑粗提物對(duì)舞毒蛾的校正死亡率從大到小依次為石油醚＞三氯甲烷＞丙酮＞乙醇。

不同植物同一溶劑提取的粗提物的殺蟲(chóng)活性不同。乙醇作為提取溶劑時(shí)，校正死亡率從大到小依次為大籽蒿＞黃花蒿＞豬毛蒿＞蒙古蒿＞野艾蒿；三氯甲烷作為提取溶劑時(shí)，大籽蒿的校正死亡率最高，其次為黃花蒿和豬毛蒿，野艾蒿和蒙古蒿最差；石油醚作為提取溶劑時(shí)，校正死亡率從大到小依次為大籽蒿＞豬毛蒿＞黃花蒿＞野艾蒿＞蒙古蒿；丙酮作為提取溶劑時(shí)，蒙古蒿和豬毛蒿的校正死亡率最高，其次為大籽蒿，再次為野艾蒿和黃花蒿。

綜上所述，觸殺試驗(yàn)中，72h校正死亡率從大到小依次為大籽蒿三氯甲烷粗提物＞黃花蒿乙醇粗提物＞豬毛蒿石油醚粗提物＞蒙古蒿丙酮粗提物＞野艾蒿石油醚粗提物，具體的校正死亡率依次為73.33%、60.00% 、56.67%、53.33% 、40% 。

3.3 胃毒試驗(yàn)

將5種蒿屬植物不同溶劑提取的粗提物配置成濃度為10、5、1mg／mL的丙酮溶液。用載毒葉碟飼喂法處理舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)，72h校正死亡率（%）見(jiàn)表4。

表4

由表4可以看出，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的濃度范圍內(nèi)，校正死亡率隨著粗提液濃度的加大而升高，并且5種蒿屬植物不同溶劑提取的粗提液的校正死亡率都不高，最好的豬毛蒿丙酮提取物，其72h校正死亡率也僅為40%。可見(jiàn)，胃毒不是這5種蒿屬植物對(duì)舞毒蛾作用的主要方式。

3.4 拒食試驗(yàn)

將5種蒿屬植物不同溶劑提取的粗提物配置成濃度為10mg／mL的丙酮溶液。用小葉碟添加法處理舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)，24h、48h拒食率（%）見(jiàn)表5、表6。

表5 粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)24h拒食試驗(yàn)

表6 粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)48h拒食試驗(yàn)

由表5、表6可以看出，野艾蒿4種溶劑粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)均具有較強(qiáng)的拒食活性，4種溶劑粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)24h拒食活性從大到小依次為石油醚、三氯甲烷、丙酮、乙醇，相對(duì)應(yīng)的拒食率大小依次為78.58%、75.84%、70.26%、68.98%；4種溶劑粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)48h拒食活性從大到小同樣是石油醚、三氯甲烷、丙酮、乙醇，相對(duì)應(yīng)的拒食率 大 小 依 次 為 89.33%、87.67%、80.31%、75.30%。由4種溶劑粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)不同處理時(shí)間的拒食率對(duì)比可以看出，處理48h的拒食率高于處理24h的拒食率，也就是說(shuō)處理48h的取食量比處理24h的取食量減少了。從表5、表6還可以看到就提取溶劑來(lái)說(shuō)，三氯甲烷的活性較高，就植物來(lái)說(shuō)，除了野艾蒿外，大籽蒿、黃花蒿、豬毛蒿對(duì)舞毒蛾也有一定的拒食活性，大籽蒿三氯甲烷粗提物對(duì)舞毒蛾3齡幼蟲(chóng)24h、48h拒食率分別為64.51%、66.57%，黃花蒿三氯甲烷粗提物24h、48h拒食率分別為50.97%、59.62%，豬毛蒿乙醇粗提物24h、48h拒食率分別為64.68%、69.67%。

4 討論

本試驗(yàn)采用3種方法對(duì)5種蒿屬植物進(jìn)行了有效物質(zhì)的提取，結(jié)果表明，超聲波提取法好于索氏提取法和冷浸提取法，然后采用超聲波提取法進(jìn)一步用丙酮、乙醇、石油醚、三氯甲烷4種溶劑對(duì)5種植物進(jìn)行有效物質(zhì)的提取，在觸殺試驗(yàn)中，大籽蒿4種溶劑的提取液都表現(xiàn)出了很好的生物活性，黃花蒿的乙醇提取液也有不錯(cuò)的生物活性；胃毒試驗(yàn)中，無(wú)論哪種植物的哪種提取液都不是很理想；在拒食試驗(yàn)中，拒食活性就提取溶劑而言，三氯甲烷活性較高。就植物而言，以野艾蒿為最好，其乙醇、三氯甲烷、石油醚、丙酮粗提物24h拒食率分別達(dá)到68.98%、75.84%、78.58%、70.26%，48h的拒食率分別達(dá)到75.30%、87.67%、89.33%、80.31%。

由以上的觸殺、胃毒、拒食試驗(yàn)可知：5種蒿屬植物對(duì)試蟲(chóng)的作用方式以觸殺為主，兼有一定的拒食作用，胃毒不是對(duì)試蟲(chóng)作用的主要方式。植物源殺蟲(chóng)劑的作用方式多種多樣，僅測(cè)定觸殺、胃毒、拒食作用并不能完全代表植物的殺蟲(chóng)活性。另外，對(duì)拒食活性的評(píng)判主要采用的是與飼喂丙酮載毒葉片的對(duì)照進(jìn)行比較，最后得出粗提物的拒食率，但試蟲(chóng)在取食一定的載毒葉片后，會(huì)表現(xiàn)出毒殺等癥狀，使試蟲(chóng)不能繼續(xù)取食，這樣相對(duì)于對(duì)照而言，處理的取食量就會(huì)減少，但這不是真正的拒食。另外粗提物在較高濃度時(shí)，試蟲(chóng)有被麻醉的跡象，這可能是熏蒸的結(jié)果。蒿屬植物對(duì)害蟲(chóng)的其他作用方式如忌避、內(nèi)吸、熏蒸、殺卵等作用仍需進(jìn)一步研究。

從國(guó)際上的發(fā)展趨勢(shì)看，研究活性植物主要是為了尋找供化學(xué)合成的先導(dǎo)活性化合物[4]。因此，應(yīng)以活性較高的提取物為基礎(chǔ)，分析其組成、結(jié)構(gòu)，從而指導(dǎo)人工合成，開(kāi)發(fā)出與環(huán)境相適應(yīng)的植物殺蟲(chóng)劑產(chǎn)品，這方面的工作有待進(jìn)一步研究。

[1]李玉平，龔寧，慕小倩.菊科植物資源及其開(kāi)發(fā)利用研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003（31）：151-156.

[2]蕭剛?cè)?中國(guó)森林昆蟲(chóng)[M].中國(guó)林業(yè)出版社.1086－1087.

[3]王立純.森林病蟲(chóng)害防治研究法[M].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)出版社，1991：2-3.

[4]徐蘇酩.天然產(chǎn)物源農(nóng)藥和農(nóng)藥先導(dǎo)物[M].農(nóng)藥譯叢，1994，2（16）：18-24.