卜貴軍 ，鄭小江，崔 琳 ，王學(xué)東*

(1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室(湖北民族學(xué)院)，湖北 恩施 445000；2.湖北民族學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000;3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命中心，黑龍江 哈爾濱 150030)

草甘膦又叫農(nóng)達，見綠殺，鎮(zhèn)草寧，是一種廣譜性的，內(nèi)吸傳導(dǎo)型除草劑[1-2].草甘膦經(jīng)葉片表面的角質(zhì)膜和氣孔吸收后，在植物細胞中，被轉(zhuǎn)化為水溶性的鹽，它的運輸?shù)闹饕绞绞牵瑥捻g皮部隨著光合作用的產(chǎn)物，輸送到生長旺盛的部位，屬于由“源”向“庫”的運輸.由于是傳導(dǎo)性除草劑，它可以殺死整個植株，其中也包括根，從而可以預(yù)防由根引起的再生[3]，達到斬草除根的功效.

草甘膦的化學(xué)結(jié)構(gòu)與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的類似，這就使得草甘膦能與PEP競爭性抑制合酶的活性，形成EPSPS合酶-3-磷酸莽草酸-草甘膦的復(fù)合物，從而抑制了合成EPSP的EPSP合成酶[4-7]，阻斷了莽草酸途徑和芳香族氨基酸的合成.草甘膦阻斷芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，就會擾亂生物體正常的氮代謝而使植物體死亡.Sutton R F等的研究表明低濃度的草甘膦可能比高濃度的更有效[8].這是由于高濃度的草甘膦一接觸植物就可以殺死組織細胞，而不能使草甘膦得到傳遞.而低濃度的草甘膦卻可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)運，直到達到根部和其他部位，殺死整個植株.

正是由于草甘膦的諸多優(yōu)點，使得草甘膦的應(yīng)用極為廣泛.在施用草甘膦時殺草時，就可能導(dǎo)致草甘膦飄逸至農(nóng)作物上，因此，有必要研究草甘膦對農(nóng)作物的傷害.此前的研究一般都利用透射電鏡來研究草甘膦對葉肉細胞的破壞[9]，用掃描電鏡來研究草甘膦對表皮細胞的破壞[10].本研究利用掃描電鏡，觀察噴施草甘膦后大豆葉肉細胞的變化，比利用透射電鏡更具立體感.

1 材料與方法

1.1 材料

大豆東農(nóng)42(GlycinmaxL. Dongnong 42).

1.2 大豆葉片超微結(jié)構(gòu)的觀察

本試驗?zāi)暝跂|北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)試驗站進行，行距65 cm，行長35 m，株距10 cm.

在幼莢期，天氣晴好時，對實驗區(qū)部分東農(nóng)42的葉片施用草甘膦.草甘膦濃度按說明書比例配制{3∶400配藥，由鶴壁市農(nóng)林制藥有限公司生產(chǎn)的草甘膦異丙胺鹽(Glyphosate)，劑型：水劑含量：41%}.分別在第1次噴藥前(0 d)和噴藥后的第1-7 d的上午9:00～11:00，取第一葉脈與第二葉脈之間的部分，用雙面刀片，切成寬度約為2 mm，長約5 mm的長條用于制備掃描電鏡樣.切好后將兩部分用牙簽輕輕撥入盛有用磷酸緩沖液配制的pH為6.8的戊二醛固定液的小瓶中，然后置于冰盒中.

掃描電子顯微鏡樣品制備：將取回的樣品經(jīng)過固定后，在經(jīng)過沖洗、脫水、置換、.用ES-2030(HITACHI)型冷凍干燥儀對樣品進行干燥、粘樣、鍍膜：用E-1010(HITACHI )型離子濺射鍍膜儀在樣品表面鍍上一層15 nm后厚的金屬膜(金或鉑膜).將處理好的樣品放入樣品盒式中待檢.最后在日立公司的S-3400掃描電鏡下觀察，并拍照.

2 實驗結(jié)果

2.1 大豆葉片柵欄組織細胞的掃描電鏡觀察

東農(nóng)42的在沒噴施草甘膦前，柵欄組織細胞，呈柱狀，排列緊密，細胞非常規(guī)則(圖版1-1)；噴藥后第1天和第2天，柵欄組織細胞未見明顯變化(圖版Ⅰ-2,3)；噴藥后第3天，柵欄組織細胞，出現(xiàn)變形，細胞變得不規(guī)則，有皺縮(圖版Ⅰ-4)；噴藥后4 d，柵欄組織細胞變形程度加大，細胞體積急劇減小，皺縮程度加劇(圖版Ⅰ-5)；噴藥后第5天以后，柵欄組織細胞變形非常嚴重，基本被瓦解(圖版Ⅰ-6,7,8).

2.2 大豆葉片海綿組織細胞的掃描電鏡觀察

東農(nóng)42的在沒噴施草甘膦前，海綿組織細胞，非常規(guī)則(圖版Ⅰ-1)；噴藥后第1天沒有明顯變化(圖版Ⅰ-2)；噴藥后第2天，海綿組織細胞有一定皺縮，變形(圖版Ⅰ-3)；噴藥后第3天，海綿組織細胞，變形明顯，皺縮加劇，細胞變得不規(guī)則(圖版Ⅰ-4)；噴藥后4天，海綿組織細胞變形程度加大，細胞體積急劇減小，皺縮加劇(圖版Ⅰ-5)；噴藥后第5天以后，海綿組織細胞變形非常嚴重，基本被瓦解(圖版Ⅰ-6,7,8).

圖1 噴施草甘膦后東農(nóng)42葉片的柵欄組織和海綿組織的掃描電鏡觀察

3 結(jié)果分析與討論

本試驗利用掃描電鏡，來研究草甘膦對東農(nóng)42的葉片的柵欄組織和海綿組織的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在按照說明書的濃度噴施草甘膦的情況下，柵欄組織和海綿組織在一定時間內(nèi)對于草甘膦的脅迫都會有一定的傷害，而且隨著天數(shù)的增加，傷害程度加大.研究發(fā)現(xiàn)海綿組織出現(xiàn)變形的時間比柵欄組織的稍早，這可能是由于草甘膦通過氣孔進入葉片的速度要大于通過角質(zhì)層進入的速度.柵欄組織在接近葉片的上表皮處，海綿組織在接近葉片的下表皮處，而上表皮的氣孔數(shù)要少于下表皮的氣孔數(shù)，因此從下表皮，也就是靠海綿組織一側(cè)進入的草甘膦要比柵欄組織一側(cè)要多，因此傷害也就越快.

草甘膦進入大豆東農(nóng)42葉片后，通過細胞壁，細胞膜進入葉肉細胞，在葉肉細胞的葉綠體中，能夠競爭抑制EPSPS的作用，從而使得東農(nóng)42的芳香族氨基酸合成受阻，影響到含有芳香族氨基酸的蛋白質(zhì)合成，以及芳香族氨基酸及其衍生物的代謝，由于草甘膦作用位置在葉綠體中，所以會導(dǎo)致細胞內(nèi)部葉綠體變形，另外，由于草甘膦作為一種外界物理作用，可能會由于滲透壓等的原因引起液泡等結(jié)構(gòu)變化，從而在微觀結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出來.這與本人對于草甘膦對大豆葉片的透射電鏡觀察結(jié)果是一致的[9].

總之，草甘膦對葉肉細胞的所產(chǎn)生的傷害，可能是一系列綜合因素的結(jié)果，一開始是由滲透壓，以及對芳香族氨基酸合成抑制所造成的，以后是由于芳香族氨基酸及其類似物缺乏，影響蛋白質(zhì)合成及代謝，使細胞內(nèi)代謝崩潰所致.

參考文獻:

[1]Malik J，Barry G,Kishore G. Minireview:The herbicide glyphosate[J]. Biofacrors，1989，2:17-25.

[2]Bradshaw L D，Padgette S R，Kimball S L，et al. Perspectives on glyphosate resistance[J]. Weed Technol，1997，11(1):189-198.

[3]Kennedy E R，Jordan P A. Glyphosate and 2，4- D: the impact of two herbicides on moose browse in forest plantations[J].Alces，1985，1:1-11.

[4]Sammons R D，Gruys K J，Anderson K S，et al. Reevaluating glyphosate as a transitionstate inhibitor of EPSP synthase: identification of an EPSP synthase EPSP glyphosate ternary complex[J].Biochem，1995，34(19): 6433-6440.

[5]Mcdowell L M，Klug C A,Beusen D D. Ligand of the ternary complex of 5-enolpyruvyl shikimate-3- phosphate synthase from rotational-echo double-resonance NMR[J].Biochem，1996，35(17): 5395-5403.

[6]Saroha M.K. Sridhar P,Malik VS.Glyphosate- tolerant crops: Genes and enzymes[J].J Plant Biochem Biotechnol，1998，7:65-772.

[7]Tan S，Evans R,Singh B. Herbicidal inhibitors of amino acid biosynthesis and herbicide-tolerant crops[J]. Amino Acids，2006，30:195-204.

[8]Sutton R F. Glyphosate herbicide: an assessment of forestry potential[J].For Chronicle，1978，54(1):24-28.

[9]卜貴軍， 鄭小江， 王學(xué)東,等.草甘膦對大豆葉片超微結(jié)構(gòu)及生化指標的影響[J].中國油料作物學(xué)報，2010，32(2):285-289.

[10]卜貴軍.噴施草甘膦對大豆表皮細胞超微結(jié)構(gòu)影響的研究[J].湖北民族學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2011，29(1):15-18.