田芳 柴玉榮 江亞南 張曉艷

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，△組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，河南 鄭州450052

食管癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居整個惡性腫瘤死亡的第6位［1］。核轉(zhuǎn)錄因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)是近年來發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，NF-κB最常見的形式是由p50和p65組成的異源二聚體。有研究表明，在多種人類腫瘤中，如肝癌、腸癌、宮頸癌，NF-κB信號通路的激活在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用［2-4］。隨著對信號傳導(dǎo)機(jī)制與腫瘤關(guān)系研究的不斷深入，研究者們逐漸認(rèn)識到針對信號傳導(dǎo)異常環(huán)節(jié)進(jìn)行腫瘤治療的重要性和可行性。在許多惡性腫瘤中，持續(xù)激活的和某些抗腫瘤藥物誘發(fā)的NF-κB活化特性，使得這個轉(zhuǎn)錄因子成為一個有前途的分子靶點(diǎn)。

RNA干擾(RNA interfere，RNAi)是一種轉(zhuǎn)錄后的基因沉默現(xiàn)象。其通過短的雙鏈RNA(small interfere RNA，siRNA)與mRNA中的同源序列結(jié)合，從而導(dǎo)致mRNA失活［5］。目前，RNAi被廣泛用于特異性抑制基因的表達(dá)，并成為研究基因功能的一種重要實(shí)驗(yàn)工具。姜黃為姜科姜黃屬植物，主要活性成分為姜黃素，具有抗感染、抗氧化、降血脂和抗動脈粥樣硬化等多種藥理作用。有研究表明，姜黃素可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，因此可以作為一種藥物或作為傳統(tǒng)化療的輔助藥物，用于腫瘤治療［6-7］。本研究利用RNA干擾技術(shù)特異性阻斷NF-κB的活化，同時研究姜黃素是否也能通過抑制NF-κB信號通路的活化，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡，并與RNA干擾技術(shù)比較判斷姜黃素阻斷該信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡的效果。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人食管癌細(xì)胞Eca109由本室保存，人食管癌細(xì)胞EC9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈。細(xì)胞在含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司)中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均處于對數(shù)生長期。

鼠抗人pIκBα(sc-8404)和鼠抗人p65(sc-8008)單克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司；細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒購自Pierce公司；NF-κB p65 siRNA干擾試劑盒購自Cell Signaling Technology公司；姜黃素粉劑(姜黃素含量≥70%)購自Sigma公司；凋亡試劑盒Annexin V-FITCKit購自美國Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的轉(zhuǎn)染

按照s i R N A干擾試劑盒說明書的要求進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前EC9706(5×104個)和Eca109(6×104個)按一定細(xì)胞數(shù)鋪于6孔板中，使用無抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，將含有siRNA的轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞共溫育5 h后，加入新鮮培養(yǎng)基溫育24 h。

1.2.2 姜黃素的配制

以少量DMSO溶解姜黃素粉劑，配成100 μmol/L的溶液，置于-20 ℃冰箱保存。臨用時以完全培養(yǎng)液將姜黃素稀釋到所需濃度，DMSO終濃度＜0.1%。對照組培養(yǎng)液為含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，其中DMSO終濃度＜0.1%。

1.2.3 細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核蛋白的制備

按照細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白提取試劑盒說明書，分別提取細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核蛋白，Bradford法檢測蛋白質(zhì)的含量，-70 ℃保存。

1.2.4 Western blot測定蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染p65siRNA 72 h后，從Eca109和EC9706細(xì)胞中取細(xì)胞質(zhì)蛋白，與預(yù)染的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)一起上樣，檢測p65和非靶向MAPK蛋白表達(dá)；并在EC9706和Eca109細(xì)胞中加入姜黃素，分別培養(yǎng)0、1、3和6 h后，收集對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，檢測pIκBα和內(nèi)參actin的表達(dá)。經(jīng)120 g/L SDS-PAGE分離，電轉(zhuǎn)到硝酸纖維膜上。5%的脫脂奶粉TBST溶液封閉2 h，抗體按1∶100溫育4 ℃過夜，TBST溶液洗滌10 min×3次，硝酸纖維膜分別與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶50 000)室溫溫育1 h后，TBST溶液洗滌10 min×3次，DAB顯色，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞

轉(zhuǎn)染p65siRNA的食管鱗癌細(xì)胞，單獨(dú)或聯(lián)合使用化療藥氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)治療后72 h；在EC9706和Eca109細(xì)胞中加入姜黃素培養(yǎng)72 h，或聯(lián)合使用姜黃素和5-FU培養(yǎng)72 h，分別收集各組細(xì)胞，制備各組單細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞。取至少1×106個細(xì)胞移入新的1.5 mL離心管中，4 ℃離心5 min，形成細(xì)胞團(tuán)。小心移去上清液，冰預(yù)冷PBS洗細(xì)胞2次，保證每管細(xì)胞數(shù)至少1×106個細(xì)胞。加5 μL Annexin V-FITC和2.5 mL PI到100 μL的細(xì)胞懸液中，輕輕混勻；以未染色細(xì)胞調(diào)零，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管作為基準(zhǔn)參照，測定每個上樣管數(shù)據(jù)，利用CellQuest 3.0軟件進(jìn)行參數(shù)獲取和資料分析，計算凋亡細(xì)胞百分比。

1.2.6 治療前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下，用倒置顯微鏡分別觀察兩種食管鱗癌細(xì)胞對照組、姜黃素組、轉(zhuǎn)染p65siRNA組、5-FU治療組及姜黃素+5-FU組、轉(zhuǎn)染p65siRNA+5-FU治療組的細(xì)胞生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)用表示，對計量資料、兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。蛋白的表達(dá)水平下調(diào)，而對非靶向蛋白MAPK的表達(dá)無影響。說明針對p65siRNA可特異性抑制p65蛋白表達(dá)，對其他蛋白的表達(dá)無影響(表1)。

2 結(jié) 果

2.1 食管鱗癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染p65siRNA后各組p65蛋白的表達(dá)水平

EC9706和Eca109細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA72 h后，收集各組細(xì)胞提取細(xì)胞質(zhì)蛋白，Western blot檢測細(xì)胞中p65的蛋白表達(dá)水平(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)染p65siRNA的EC9706和Eca109細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后的EC9706和Eca109細(xì)胞，p65

表 1 p65蛋白表達(dá)水平半定量分析Tab.1 The protein expression of p65 after transfected with p65siRNA

2.2 姜黃素對NF-κB信號通路的阻斷作用

在EC9706和Eca109細(xì)胞中加入姜黃素，劑量為50 μmol/L，分別培養(yǎng)0、1、3和6 h后，提取相應(yīng)的細(xì)胞質(zhì)蛋白，檢測姜黃素對NF-κB信號通路的作用。Western blot檢測結(jié)果顯示，EC9706和Eca109細(xì)胞中pIκBα蛋白的表達(dá)水平隨姜黃素作用時間的延長逐漸下降(圖2)，IκBα磷酸化水平降低，可直接影響NF-κB的活化(表2)。

2.3 兩種阻斷方法對EC9706和Eca109細(xì)胞凋亡的影響

將p65siRNA轉(zhuǎn)染組與姜黃素組所引起的食管鱗癌細(xì)胞的凋亡及聯(lián)合應(yīng)用化療藥所引起的細(xì)胞凋亡進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與p65siRNA轉(zhuǎn)染組相比，單獨(dú)使用姜黃素可引起細(xì)胞凋亡數(shù)增加(P＜0.05)；當(dāng)聯(lián)合使用化療藥時，細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯增加，尤其是當(dāng)姜黃素與5-FU聯(lián)合應(yīng)用時，作用更加顯著(P＜0.05，表3)。

表 2 pIκBα蛋白表達(dá)水平半定量分析Tab.2 The protein expression of pIκBα in different concentrations of curcumin

2.4 姜黃素、p65siRNA與5-FU聯(lián)合應(yīng)用對食管鱗癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)特性的影響

姜黃素及p65siRNA轉(zhuǎn)染72 h后，EC9706和Eca109細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)縮小，漂浮數(shù)增加，細(xì)胞增殖較慢；姜黃素及p65siRNA與化療藥5-FU聯(lián)合作用72 h，EC9706和Eca109細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)縮小，細(xì)胞質(zhì)凝縮，細(xì)胞漂浮數(shù)明顯增加，細(xì)胞數(shù)量下降，增殖明顯受到抑制(圖3、4)。

表 3 流式細(xì)胞儀檢測姜黃素對EC9706和Eca109細(xì)胞凋亡率Tab.3 The apoptosis rates of EC9706 and Eca109 cells detected by fl ow cytometry

3 討 論

活化的NF-κB信號通路可促進(jìn)多種下游調(diào)控基因的表達(dá)，這些基因的過表達(dá)在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生成、轉(zhuǎn)化、浸潤和轉(zhuǎn)移、抗凋亡及增加對化療藥的耐藥性等方面起著重要的作用，腫瘤的這些特征將會使患者的預(yù)后欠佳。因此，抑制NF-κB信號通路或許有助于下調(diào)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的基因表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性。

作者以往的研究已證實(shí)，在2種食管鱗癌細(xì)胞中存在有激活NF-κB的信號通路［8-9］，然而能否通過阻斷NF-κB信號通路，促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞的凋亡及增強(qiáng)對化療藥的敏感性，目前尚不清楚。在功能基因組研究中，需要對特定基因進(jìn)行功能喪失或降低突變，以確定其功能。由于RNAi具有高度的序列專一性，可以使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變。本研究使用RNA干擾技術(shù)，特異性阻斷NF-κB亞單位p65的表達(dá)，研究NF-κB信號通路在食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用。本研究中，將p65siRNA分別轉(zhuǎn)染EC9706和Eca109細(xì)胞，持續(xù)作用72 h，檢測p65的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，p65的蛋白表達(dá)水平明顯下降，而非靶向抗體MAPK的表達(dá)水平未受到影響。姜黃素可以通過不同的機(jī)制產(chǎn)生抗炎抗腫瘤的特性［10］。研究表明，姜黃素可以通過干預(yù)NF-κB信號通路，影響腫瘤細(xì)胞的生長和凋亡［11-12］。本研究結(jié)果顯示，EC9706和Eca109細(xì)胞中pIκBα蛋白的表達(dá)水平隨著姜黃素作用時間的延長逐漸下降，IκBα磷酸化水平的降低，會直接影響NF-κB的活化［13］。因此，姜黃素可以抑制食管鱗癌細(xì)胞中IκBα磷酸化，使NF-κB不能從NF-κB-IκBα復(fù)合物上解離，降低NF-κB-DNA的結(jié)合活性。

有證據(jù)表明，細(xì)胞出現(xiàn)凋亡異常，會引起腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，更重要的是引起腫瘤細(xì)胞對化療藥的耐受性。在腎癌細(xì)胞中，姜黃素可以誘導(dǎo)死亡受體在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)，從而促進(jìn)由腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體誘發(fā)的細(xì)胞凋亡［14］。本研究還采用流式細(xì)胞儀檢測姜黃素、p65siRNA單獨(dú)或聯(lián)合使用化療藥5-FU對食管鱗癌細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，EC9706和Eca109在單獨(dú)使用姜黃素后，就可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；當(dāng)與化療藥5-FU(327 μg/mL)聯(lián)合使用時，可明顯提高腫瘤細(xì)胞對化療藥的敏感性，凋亡和壞死的細(xì)胞均顯著增加。同時，將siRNA轉(zhuǎn)染組與姜黃素組所引起的食管鱗癌細(xì)胞的凋亡及聯(lián)合應(yīng)用化療藥所引起的細(xì)胞凋亡加以比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與siRNA轉(zhuǎn)染組相比，單獨(dú)使用姜黃素可引起細(xì)胞凋亡數(shù)增加(P＜0.05)；當(dāng)聯(lián)合使用化療藥時，細(xì)胞凋亡數(shù)均明顯增加，與p65siRNA聯(lián)合5-FU組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

以上結(jié)果顯示，姜黃素也可以通過抑制NF-κB信號通路，增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞對化療藥5-FU的敏感性，使腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)增加。與特異性的p65siRNA干擾技術(shù)相比，姜黃素單獨(dú)或與5-FU聯(lián)合應(yīng)用，都能夠明顯增加食管鱗癌細(xì)胞的凋亡數(shù)，提示姜黃素不但可以通過阻斷NF-κB的活性起作用，或許還可以通過其他機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過顯微鏡也可清楚地觀察到食管鱗癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的一些改變。本研究使用兩種方法作用于NF-κB信號通路，RNA干擾技術(shù)具有高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，可特異性地阻斷NF-κB信號通路，用于研究NF-κB信號通路在食管鱗癌細(xì)胞中的功能；RNA干擾雖特異，但用于臨床還需要一段時間。而姜黃素作為一種化合物，不良反應(yīng)小、無毒，可以抑制食管鱗癌細(xì)胞中IκBα磷酸化，從而阻斷NF-κB信號通路，增強(qiáng)食管鱗癌細(xì)胞對5-FU的敏感性，使腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)增加。

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