雷祖培，余宏傲，張書潤，林瑞豐，康華靖

（1.浙江烏巖嶺國家級自然保護區(qū) 管理局，浙江 泰順 325500；2.溫州科技職業(yè)學院 園林系，浙江 溫州 325006）

浙江雪膽Hemsleya zhejiangensis為葫蘆科Cucurbitaceae雪膽屬Hemsleya多年生攀援草本，僅分布于浙江溫州泰順烏巖嶺海拔800 m以下的山谷灌叢中和竹林下，為浙江特有種[1]。浙江雪膽塊莖具有清熱解毒、消腫止痛之功效，廣泛用于治療腸炎、菌痢、冠心病、氣管炎、慢性子宮頸炎、帶狀皰疹、腫瘤等多種疾病[2-4]。因其療效好，副作用低，因而在醫(yī)學上日益受到青睞，應用前景十分廣闊。目前，對浙江雪膽的研究較少，哀建國等[5]對浙江雪膽群落學特征進行了調查研究；雷祖培等[6]對浙江雪膽體內幾種金屬元素分布及其與土壤養(yǎng)分之間的關系進行了研究；葉曉霞等[4]探討了超聲提取——分光光度法測定浙江雪膽中總皂苷含量；葉曉霞等[7]從藥用角度測定浙江雪膽塊莖中的微量元素，證明浙江雪膽中含有豐富的人體必需微量元素，且微量元素的含量明顯高于中華雪膽，這為浙江雪膽的進一步的開發(fā)利用提供了科學依據(jù)。由于浙江雪膽種群稀少，使用莖蔓扦插繁殖母本數(shù)量極少，扦插繁殖速度慢，同時容易受季節(jié)限制，嚴重阻礙了以這一新藥源植物的生產(chǎn)利用。本研究主要通過研究浙江雪膽的初代培養(yǎng)基和最佳植物生長調節(jié)物質配比對其增殖的影響，以進一步為塊莖的快速誘導和增殖打下良好的基礎，最終實施人工栽培，以解決其資源匱乏和物種的有效保護。

1 材料與方法

1.1 材料

浙江雪膽塊莖于2008年12月采自浙江烏巖嶺國家級自然保護區(qū)內竹林下的雪膽群落，栽植于裝有腐殖質土的花盆中，待長出幼苗后，采集具芽的幼嫩莖段作為外植體。試驗于2009年2月至2010年5月在溫州科技職業(yè)學院農(nóng)生系生物工程研究所植物組織培養(yǎng)實驗室中完成。

1.2 試驗方法

剪取莖段，用洗滌劑涮洗后自來水沖洗1 h，再用蒸餾水沖洗3次，然后在超凈工作臺中進行操作。用體積分數(shù)為70%乙醇浸泡30 s，100.0 g·kg-1次氯酸鈉浸泡8 min進行殺菌。消毒后的幼嫩莖段用無菌水浸洗5次，剪去基部，留1 cm左右的莖段，插栽在固體MS（Murashige and Skoog）基本培養(yǎng)基（蔗糖30.0 g·kg-1，瓊脂6.0 g·kg-1，pH 5.8）中，插入深度2～3mm。 在 （25±2）℃組培室中培養(yǎng)。7 d后除去污染瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，21 d時轉接，然后進行以下植物生長調節(jié)物質和培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)影響的研究。

1.2.1 6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA）對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，附加α萘乙酸（NAA）0.02 mg·L-1，酸堿度整為pH 5.8～6.0；蔗糖為30.0 g·L-1，瓊脂作凝固劑。設置質量濃度分別為0， 0.10， 0.20， 0.50， 1.00， 2.00， 5.00 和 10.00 mg·L-1。

1.2.2 NAA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA 1.00 mg·L-1，設置質量濃度分別為 0， 0.01， 0.05， 0.10， 0.50和 1.00 mg·L-1。

1.2.3 不同質量濃度NAA和6-BA配比對繁殖系數(shù)的影響 以MS為基本培養(yǎng)基，附加6-BA和NAA，均設置5個質量濃度（2.00，1.00，0.50，0.10和0 mg·L-1）組合進行不同配比試驗。1.2.4 不同基本培養(yǎng)基對繁殖系數(shù)的影響 分別以MS，B5，N6和WPM（woody plant medium）等4種培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，附加植物生長調節(jié)物質6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1進行培養(yǎng)試驗。

在光照強度為2000 lx左右，光照時間為10 h·d-1的培養(yǎng)室中進行恒溫（25±2）℃培養(yǎng)35后，記錄不同處理下浙江雪膽生長情況和繁殖系數(shù)。繁殖系數(shù)是指在一次繼代培養(yǎng)中，由一個繁殖單位（嫩莖、芽、或芽叢等）產(chǎn)生的新苗 （芽）個數(shù)。以上實驗均設5個重復，求其平均數(shù)。

表1 6-BA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table1 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of 6-BA

2 結果與討論

2.1 6-BA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

不同6-BA質量濃度對浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)影響較大，不同質量濃度之間差異都達到顯著水平 （表1）。 在質量濃度 0.1～10.00 mg·L-1范圍內，浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)隨6-BA質量濃度的升高而呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在0.50 mg·L-1時其繁殖系數(shù)最大，達到10.80；其次為1.00 mg·L-1，其值達到 6.80；再次為 0.20 mg·L-1和 2.00 mg·L-1； 其余質量濃度下浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)較低。

2.2 NAA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)在NAA質量濃度為0 mg·L-1時，組培苗的繁殖系數(shù)為1.0；在低質量濃度（小于0.20 mg·L-1）下，其繁殖系數(shù)隨著NAA質量濃度的升高而增大，在0.20 mg·L-1時其值最大，達到5.6（表2）；當NAA質量濃度增加至0.50 mg·L-1時，浙江雪膽組培苗的繁殖系數(shù)開始受到抑制。

2.3 不同質量濃度的NAA和6-BA配比對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

不同質量濃度的NAA和6-BA配比對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響結果見表3。試驗表明：最適宜于浙江雪膽組培快繁的芽分化誘導培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1和MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1。2種配方下的浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)無顯著差異。

表2 NAA對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table2 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of NAA

表3 6-BA和NAA不同質量濃度配比對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table3 Effect on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis of 6-BA and NAA

2.4 不同基本培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響

以WPM，B5，N6和MS為基本培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響見表4。不同培養(yǎng)基下浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)均較高，其中以MS培養(yǎng)基的效果最佳，其繁殖系數(shù)達到16.80，與其他3種培養(yǎng)基相比，其差異達到了顯著水平。

表4 不同培養(yǎng)基對浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)的影響Table4 Effect of basic medium on the propagation coefficient of Hemsleya zhejiangensis

3 討論和結論

試驗表明：在沒有植物生長調節(jié)物質處理下，浙江雪膽組培苗繁殖系數(shù)均為1.00；不同6-BA和NAA質量濃度對其組培苗繁殖系數(shù)有較大影響，最佳質量濃度分別為0.50 mg·L-1和0.20 mg·L-1，其繁殖系數(shù)分別為10.80和5.60；6-BA對浙江雪膽叢生芽分化的促進作用顯著高于NAA。不同質量濃度的NAA和6-BA配比的最佳配方為MS+6-BA 1.00 mg·L-1+NAA 0.02 mg·L-1和 MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.05 mg·L-1， 2 種配比下組培苗繁殖系數(shù)分別為19.30和18.10，與單一植物生長調節(jié)物質最佳質量濃度下相比，其差異也均達到了顯著水平。

通過試驗觀察，25～35 d為1個繼代周期是較為適宜的，因為這個時期誘導的效果可以充分表現(xiàn)出來，而培養(yǎng)基的成分還沒有完全變化到影響組織的生長，并且可為轉接提供較大量的材料。浙江雪膽對組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基成分的要求并不嚴格，基本培養(yǎng)基MS，B5，N6和WPM均可作為組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，都可滿足浙江雪膽生長的需要，就快速繁殖而言，MS和B5培養(yǎng)基是比較適宜的培養(yǎng)基。

植物組織培養(yǎng)再生小植株一般有3條途徑：一是外植體先形成愈合組織，愈合組織分化出不定芽，由不定芽再發(fā)育成小植株；二是由外植體表面直接誘導產(chǎn)生小鱗莖或小芽，再由小鱗莖或不定芽發(fā)育成小植株；三是由組織表層和內層一些特化了的胚性細胞經(jīng)多次分裂發(fā)育成胚狀體而形成小鱗莖，小鱗莖再形成小植株。本實驗采用第1種途徑，該方法較易進行，但繁殖周期較長。本實驗發(fā)現(xiàn)除了以上3種增殖方式外，浙江雪膽的組培苗在初代培養(yǎng)（2009年2月）中不經(jīng)生根階段就可形成微型塊莖（2009年9月）（圖1），且該微型塊莖可直接發(fā)育成新個體。此法如能和莖尖培養(yǎng)結合起來，將為浙江雪膽脫毒種塊莖的繁育建立很好的體系。但是第2年（2010年）繼代培養(yǎng)則未發(fā)現(xiàn)微型塊莖的形成，推測與取樣時間和部位相關，具體原因尚需進一步研究。

圖1 分別為浙江雪膽的花、塊根、初代培養(yǎng)幼苗和愈合組織Figure1 Hemsleya zhejiangensis： flower， tuber， initial culture seedling and callus

[1]胡紹慶，丁炳揚，陳征海.浙江省珍稀瀕危植物物種多樣性保護的關鍵區(qū)域[J].生物多樣性，2002，10（1）：15-23.HU Shaoqing， DING Bingyang， CHEN Zhenghai.The critical regions for conservation of rare and endangered plant species diversity in Zhejiang Province [J].Biodiversity Sci， 2002， 10 （1）： 15-23.

[2]施亞琴，楊培金，王化遠，等.巨花雪膽中的兩種皂甙[J].華西藥學雜志，1995，10（2）：90-92.SHI Yaqin， YANG Peijin， WANG Huayuan， et al.Two saponins isolated from Hemsleya gigantha [J].West China Pharmaceut Sci， 1995， 10 （2）： 90-92.

[3]陶朝陽，易楊華，林厚文，等.雪膽根抗腫瘤活性成分研究[J].第二軍醫(yī)大學學報，1999，20（5）：337-339.TAO Zhaoyang， YI Yanghua， LIN Houwen， et al.Study of activity component to antineoplastic in Hemsleya sinesis’s root[J].Acad J Sec Mil Med Univ， 1999， 20 （5）： 337-339.

[4]葉曉霞，丁立生，黃可新.超聲提取-分光光度法測定浙江雪膽中總皂苷含量[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006，18（4）： 631-633， 662.YE Xiaoxia， DING Lisheng， HUANG Kexin.Studies on determination of the total saponins in Hemsleya zhejiangens[J].Nat Prod Res Dev， 2006， 18 （4）： 631-633， 662.

[5]哀建國，俞琳，章麗英，等.浙江雪膽群落學特征研究[J].浙江林學院學報，2007，24（6）：706-710.AI Jianguo， YU Lin， ZHANG Liying， et al.Plant community properties in a Hemsleya zhejiangensis habitat in Wuyanling Nature Reserve， Zhejiang Province [J].J Zhejiang For Coll， 2007， 24 （6）： 706-710.

[6]雷祖培，張書潤，康華靖，等.浙江雪膽幾種金屬元素分布及其與土壤養(yǎng)分之間的關系 [J].中國野生植物資源，2010， 29 （4）： 48-52.LEI Zupei， ZHANG Shurun， KANG Huajing， et al.Element distribution and its relationship with soil nutrients of Hemsleya zhejiangensis[J].Chin Wild Plant Resour， 2010， 29 （4）： 48-52.

[7]葉曉霞，蔣絳雪，艾常春，等.ICP-AES法測定浙江雪膽中的微量元素[J].廣東微量元素科學，2005，12（9）：26-29.YE Xiaoxia， JIANG Jiangxue， AI Changchun， et al.Determination of trace elements in Hemsleya zhejiangensis[J].Guangdong Trace Elem Sci， 2005， 12（9）： 26-29.