費建明 吳 巖 占鵬飛 李玉峰 王文兵

(1浙江省湖州市農(nóng)業(yè)科學研究院,浙江湖州 313000; 2江蘇大學生命科學研究院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

家蠶 Bm NPV多角體蛋白與大腸桿菌L-天冬酰胺酶Ⅱ的融合表達

費建明1吳 巖2占鵬飛1李玉峰1王文兵2

(1浙江省湖州市農(nóng)業(yè)科學研究院,浙江湖州 313000;2江蘇大學生命科學研究院,江蘇鎮(zhèn)江 212013)

L-天冬酰胺酶是一種重要的蛋白類抗腫瘤藥物,可通過降解 L-天冬酰胺從而抑制腫瘤細胞中蛋白質(zhì)的正常合成,導致腫瘤細胞的死亡。通過基因融合的方法,將大腸桿菌的asp基因在家蠶桿狀病毒中表達,其活性進一步提高到 5 940 U/mg,為利用家蠶生物反應器生產(chǎn)該蛋白打下了基礎。

家蠶;多角體;L-天冬酰胺酶;大腸桿菌

L-天冬酰胺是蛋白質(zhì)合成必需的氨基酸。腫瘤細胞中天冬酰胺合成酶(asparagines synthetase,AS)活性非常低,不能有效合成 L-天冬酰胺,需依賴外源 L-天冬酰胺才能生存和復制。L-天冬酰胺酶(L-asparaginase,L-ASP)可通過降解 L-天冬酰胺從而抑制腫瘤細胞中蛋白質(zhì)的正常合成,導致腫瘤細胞的死亡［1-3］。L-ASP是一種重要的蛋白類抗腫瘤藥物,在臨床上廣泛用于淋巴瘤和兒童急性淋巴細胞白血病、黑素肉瘤、胰腺癌及霍金森病等疾病的治療［3-4］。L-天冬酰胺酶Ⅱ的生產(chǎn)大多采用以大腸桿菌為宿主的基因工程菌,存在著發(fā)酵水平低和分離純化步驟繁多等問題［2］,難以廣泛應用。本試驗通過基因融合的方法,將大腸桿菌的 asp基因在家蠶桿狀病毒中表達,以提高其活性,為利用家蠶生物反應器生產(chǎn)該蛋白打下了基礎。

1材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、細胞和菌株 pFastBac1載體、DH10BacTM、BmN細胞,由中國科學院上海生物化學與細胞研究所桿狀病毒組饋贈;pFastBacHTb-asp重組載體、大腸桿菌 DH5α、鼠源的單克隆多角體抗體,由江蘇大學生命科學研究院醫(yī)學組實驗室保存。

1.1.2 酶和試劑 BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ等限制性內(nèi)切酶,T4 DNA連接酶、質(zhì)粒柱抽試劑盒、膠回收試劑盒等購自 TaKaRa公司;Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑購自 Invitrogen公司;TC-100培養(yǎng)基、FBS等購自GIBCO公司。HRP標記的羊抗鼠的 Ig抗體、化學發(fā)光劑為 Pierce公司產(chǎn)品,Protein Marker為 Fermentas公司產(chǎn)品,Prestained Protein Marker為 BioLab公司產(chǎn)品?；瘜W試劑均為國產(chǎn)分析純。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2 試驗方法

1.2.1 目的基因克隆及序列分析 根據(jù) GenBank中 BmNPV多角體基因(polh)序列,設計引物 P1:AGGGA TCCatg ccg aat tat tca tac,P2 :CCGAA TTC ata cgc cgg acc agt gaa(下劃線表示酶切位點,以下相同),其中在上下游引物分別引入BamHⅠ和 EcoRⅠ酶切位點。根據(jù) pFastBacHTb-asp DNA序列設計引物,其中在上游引物(P3:GAG GGA TCC GAA AACCTG TAT TTTCAG)引入 EcoRⅠ酶切位點,在下游引物(P4:GG AAG CTT TTA GTA CTG ATT GAA GAT CTG CT)引入 HindⅢ酶切位點。將上述擴增產(chǎn)物分別與 pMD18-T simple vector連接。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒的抽提等基因操作,參照文獻［2］進行。酶切鑒定的陽性質(zhì)粒,送到上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)移載體 pFastBac1-polh-asp的構(gòu)建 由BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶切 pMD18-T-polh,將切下的polh插入至同樣酶切的 pFastBac1,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pFastBac1-polh;然后再將 pMD18-T-tev-asp由 EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切,將切下的 tev-asp插入至由同樣酶切的 pFastBac1-polh中,構(gòu)建成重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-polh-asp。

1.2.3 轉(zhuǎn)座重組及重組病毒的獲得 將構(gòu)建好的轉(zhuǎn)移載體 pFastBac1-polh-asp轉(zhuǎn)化 DH10BacTM,涂布于含 K X-gal(1mg/L)、IPTG(0.8mg/L)、慶大霉素(7μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、四環(huán)素(10μg/m L)的 LB平板,48 h左右挑取白色菌落重新劃線,待長出白色菌落后接種于含相應抗生素的 LB培養(yǎng)基中,提取重組 Bacmid DNA,用 M13引物(M 13 Forward(-40):GTTTTC CCA GTC ACG AC,M 13 Reverse:CAGGAA ACA GCT ATG AC)PCR鑒定正確后,得到重組 bacmid-polh-asp。

將提取的重組 Bacmid-polh-asp DNA在脂質(zhì)體的介導下轉(zhuǎn)染昆蟲細胞 BmN,28℃培養(yǎng) 120 h后觀察細胞中多角體的產(chǎn)生,用 15 mL的離心管收集孔板中含重組桿狀病毒的培養(yǎng)液,1 000 r/min離心5 min以去除細胞及較大的碎片,收集上清即得到原代重組桿狀病毒 Bac-asp,并再次感染 BmN細胞,收集病毒液。

1.2.4 Western blot分析 感染的細胞經(jīng)離心后去上清。用磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞并再懸浮,再加入等量的 2×SDS凝膠上樣緩沖液,混勻后,于沸水中煮沸,取上清液按文獻［5］進行 8%SDSPAGE。將蛋白轉(zhuǎn)印至尼龍膜上,進行抗體檢測。

1.2.5 L-天冬酰胺酶Ⅱ活性分析 使用奈氏試劑(the Nessler reagent)來檢測 L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性［3］。標準濃度樣品為己知濃度的硫酸銨。為排除桿狀病毒自身的影響,以 BmBacPAK6為對照。具體步驟如下:將上述收集的細胞懸浮在 2 m L PBS中,采用冰上超聲波破碎。破碎條件為強度 70,每超聲 15 s,于冰中靜置 15 s,如此反復 20次。將100μL的上清與終濃度為 0.25%的底物 L-Asn(溶于 100mmol/L PBS,pH 8.0)混合,在 37℃的水浴中孵育 15 min,用終濃度 5%的三氯醋酸溶液終止反應。加入奈氏試劑,室溫反應 15min后于450 nm波長下讀取吸收值。L-天冬酰胺酶Ⅱ的酶活性定義為能使底物每分鐘釋放切 1μmol氨的酶量為 1個單位。相關蛋白質(zhì)濃度的測定方法采用 BCA蛋白濃度測定試劑盒。

2 結(jié)果

2.1 重組載體 pFastBac1-polh的酶切鑒定

BamHⅠ和 EcoRⅠ雙酶切 pFastBac1-polh,切出一條 740 bp大小的片段(圖 1),其與 polh的PCR產(chǎn)物大小一致,表明重組載體 pFastBac1-polh構(gòu)建成功。

圖 1 pFastBac1-po lh的酶切鑒定

2.2 重組轉(zhuǎn)移載體 pFastBac1-polh-asp的酶切鑒定

用 EcoRⅠ和 HindⅢ雙酶切 pFastBac1-polhasp,得到約 1 000 bp插入片段,其大小與 asp加TEV酶酶切位點對應的核苷酸序列一致(圖 2,泳道1和 2)。由 BamHⅠ單酶切 pFastBac1-polh-asp,切出一條 760 bp大小的片段,這與 polh加 TEV酶酶切位點對應的核苷酸序列的大小一致(圖 2)。結(jié)果表明重組轉(zhuǎn)移載體 pFastBac1-polh-asp構(gòu)建成功。

圖 2 pFastBac1-polh-asp的酶切鑒定

2.3 Western blot分析

將重組桿狀病毒 r-polh-asp和親本病毒 Bm-pBacPAK6(對照)分別感染昆蟲細胞 BmN。培養(yǎng)72 h后,收集感染的細胞。通過 Western blotting對重組病毒的表達結(jié)果進行檢驗。結(jié)果表明含重組病毒 r-polh-asp的表達產(chǎn)物在略大于 62 kD處出現(xiàn)一條特異條帶,與預期的結(jié)果(產(chǎn)物分子量 65 kD)相符,而 Bm-pBacPAK6感染的細胞并沒有對應的蛋白帶的出現(xiàn),說明 polh和 asp基因在昆蟲細胞 BmN中成功融合表達。

圖 3 重組病毒r-polh-asp的表達產(chǎn)物的Western blotting

2.4 L-天冬酰胺酶Ⅱ活性分析

活性使用奈氏試劑(the Nessler reagent)來檢測L-天冬酰胺酶Ⅱ的活性。標準濃度樣品為己知濃度的硫酸銨。為排除桿狀病毒自身的影響,以 Bm-BacPAK6為對照。根據(jù)標準曲線計算出在家蠶細胞 BmN中表達的重組大腸桿菌 L-天冬酰胺酶Ⅱ活性為 5 940U/mg。

3 討論

L-天冬酰胺酶Ⅱ是一種重要的蛋白類抗腫瘤藥物。與普通化療抗癌藥相比,L-天冬酰胺酶Ⅱ既可抑制癌細胞增殖,又不傷害正常細胞,有效地實現(xiàn)了酶的特異抗癌作用,因而倍受關注［6-7］。目前,L-天冬酰胺酶Ⅱ的生產(chǎn)大多采用以大腸桿菌為宿主的基因工程菌,進行發(fā)酵。但是由于在生產(chǎn)上存在著發(fā)酵水平低和分離純化步驟繁多兩方面的問題,國內(nèi)臨床上所用注射 L-天冬酰胺酶主要是依靠進口。因此,構(gòu)建能高效表達L-天冬酰胺酶并且其表達產(chǎn)物易于被純化的表達系統(tǒng)尤為重要。

桿狀病毒表達系統(tǒng)相對于大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞表達系統(tǒng)具有以下幾個方面的優(yōu)點［8］:一是操作過程安全性高;二是病毒基因組內(nèi)的多角體基因(polh)等都是病毒復制的非必需基因,其啟動子是強啟動子;三是可容納較大的外源片段的插入而不影響基因表達和病毒復制及包裝;四是表達水平較高。因此,在本實驗中選擇桿狀病毒表達系統(tǒng)。

為了更高效、更快速地純化表達產(chǎn)物,將多角體基因和 L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表達,其中間以 TEV酶酶切位點連接。多角體基因和 L-天冬酰胺酶Ⅱ融合表達有以下優(yōu)點:一是便于確定細胞是否被感染,根據(jù)細胞是否出現(xiàn)多角體,判斷其感染情況。二是多角體是純化 L-天冬酰胺酶Ⅱ的接頭蛋白,通過偶聯(lián)多角體蛋白抗體的親和層析柱純化能得到純的多角體和 L-天冬酰胺酶Ⅱ融合蛋白。三是由于重組桿狀病毒 r-polh-asp能形成多角體,可以通過喂食多角體,使病毒 r-polh-asp感染家蠶并在其體內(nèi)表達L-天冬酰胺酶Ⅱ;喂食多角體比注射法損傷更小。

［1］Narta UK,Kanwar SS,AzmiW.Pharmacologicaland clinical evaluation of L-asparaginase in the treatment of leukemia［J］.Crit Rev Oncol Hem Atol,2007,61(3):208-211.

［2］Kotzia GA,Labrou NE.Cloning,expression and characterisation of Erw inia carotovora L-asparaginase［J］.JBiotechnol,2005,119(4):309-323.

［3］李曉媛,陳建華,吳梧桐.PEG-L-天冬酰胺酶的臨床研究近況［J］.藥學進展,2009,33(11):503-510.

［4］Pozsnsky M J,Shandling M,Salkem A.Advantages in theuse of L-asparaginase album in polymer as an antitumor agent［J］.Can Res,1982,42:1 020-1 024.

［5］J.莎姆布魯克 .分子克隆實驗指南［M］.金冬雁,黎孟楓,譯.北京:科學出版社,1995.

［6］Rosti G,Trabacchi E,Bassi S,et al.Risk and early cytogenetic reponse to imatinib and interferon in chronic myeloid leukemia［J］.Haematologica,2003,88(3):256-259.

［7］Fernandes A I,GregoriadisG.The effect of polysialylation on the immunogencity and antigencitityofasparaginase:implication in its pharmacokinetics［J］.IJP,2001,217:215-224.

［8］呂鴻聲.昆蟲病毒分子生物學［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學出版社,1998:547-580.

S881.2

A

1007-0982(2011)02-0029-03

2011-02-18;

2011-03-05

費建明(1962—),男,浙江湖州,碩士,高級農(nóng)藝師。

Tel:0572-2821600,E-mail:ajfjm@163.com