吳然 程波 賈敏

(1.貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院皮膚科，貴陽550001;2.福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，福州350001)

近年來，隨著廣譜抗生素和糖皮質激素的濫用、隱形眼鏡的普及及艾滋病等免疫缺陷性疾病的增加，真菌性角膜炎的發(fā)病率在不斷上升［1］。研究顯示煙曲霉較其他曲霉菌對人體組織有更強的黏附性和致病性［2］，是我國真菌性角膜炎的主要致病菌種之一［3］。一旦感染了煙曲霉，患者的視力將受到不同程度的損害，甚至永久性失明，因此，本實驗根據(jù)我國真菌性角膜炎的流行病學調查結果，選擇煙曲霉作為病原體，建立煙曲霉角膜炎的小鼠模型，初步探討煙曲霉對角膜的致病條件、損傷機制，以期促進曲霉病的實驗和臨床研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

菌株及動物 煙曲霉 取自福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科真菌實驗室保存的菌種。清潔級昆明小白鼠 (ICR)6～8周齡，體重 (30±0.5)g，雌雄兼用，福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供，無眼疾。

主要試劑及配制方法 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基按中華人民和國國家標準，微生物學檢測方法GB/T14926.43-2001 4.16 和 4.17 方法進行配制［4］。

儀器設備 OlympusRCK40-32PH光學顯微鏡、手術用雙眼顯微鏡、裂隙燈顯微鏡、電熱恒溫培養(yǎng)箱、血球計數(shù)板、組織研磨器 、1 mL結膜注射針等。

1.2 實驗方法

煙曲霉分生孢子懸液的制備 收集PDA培養(yǎng)平皿蓋內完全純化的煙曲霉孢子，用生理鹽水稀釋成孢子混懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子混懸液調配成 102、104、106、108(單位 CFU/mL)備用。

實驗小鼠模型的建立 ①劃痕法:選取正常實驗用小鼠36只，根據(jù)所接種菌液濃度102CFU、104CFU、106CFU、108CFU及生理鹽水分為5組，分別標記1、2、3、4 、5 組，其中 3、4 、5 小鼠數(shù)量均為6只，鑒于預實驗中發(fā)現(xiàn)接種低濃度菌液時小鼠角膜感染率極低，故1、2組小鼠分別選取10只和8只，所有模型小鼠均取單側眼角膜進行接種實驗。全部將小鼠以10%水合氯(400 mg/kg)腹腔注射麻醉后，于手術顯微鏡下用1 mL結膜注射針在小鼠單側角膜表面造成#字形淺表劃傷，盡量刮除#字各區(qū)角膜上皮層后，第 1、2、3、4組表面涂以10μL預制的煙曲霉孢子懸液，含量分別為 102CFU 、104CFU、106CFU、108CFU，第 5組滴入生理鹽水作對照，然后閉合小鼠瞼裂并輕輕揉搓上下眼瞼，使煙曲霉孢子混懸液或生理鹽水能均勻分布在劃傷的角膜表面。接種24小時后每天在裂隙燈和手術顯微鏡下觀察角膜病變，比較各組感染率及病變程度。②免疫抑制劑處理后加用劃痕法:隨機選取6只正常小鼠，于接種孢子前 5 天、前 3 天、前 1 天按 180 mg·kg-1·d-1［5］給小鼠肌注環(huán)磷酰胺，之后采取劃痕法給小鼠單眼接種10 L(含106CFU)煙曲霉孢子混懸液，接種24 h后觀察角膜病變。③角膜基質注射法:選取6只正常小鼠，予10%水合氯醛麻醉腹腔注射麻醉后，在手術顯微鏡指導下，用結膜注射針在小鼠角膜中央1/3～1/2基質層，注入煙曲霉孢子懸液10μL(含106CFU)，閉合小鼠瞼裂并適當搓揉使菌液充分黏附于角膜組織中。

1.3 實驗結果觀察方法

模型建立后，在不同時間對病變角膜行肉眼觀察評分﹑真菌鏡檢﹑真菌培養(yǎng)及組織病理學檢查。

模型小鼠角膜病灶觀察評分 自接種24 h起，每天將小鼠麻醉后在手術顯微鏡和裂隙燈顯微鏡下觀察角膜病變，并予臨床評分。評分標準參照Wu TG等［5］的方法:根據(jù)造模后小鼠角膜的混濁面積、混濁深度及角膜表面平整光滑度分別予以評分，3項的分數(shù)相加為該眼的總分，根據(jù)此法，正常未受外傷的角膜總評為0分，臨床病情分度:總分≤5分為輕度、6～9分為中度、≥10分為重度。

模型小鼠角膜組織真菌鏡檢及培養(yǎng) 接種后第5天，將小鼠麻醉后，用無菌鈍性刀片刮取適量病變角膜表面分泌物，置于無菌載玻片上，滴1～2滴10%KOH，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察有無菌絲及孢子，與此同時刮取盡可能多的病變角膜標本，按點植法接種在SDA培養(yǎng)基上，置于28℃恒溫箱中進行培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況。

模型小鼠角膜組織病理活檢 造模后24 h隨機選取角膜病變呈中度發(fā)病小鼠10只，分別于接種后第36 h、4 d、7 d、10 d、14 d 行頸椎脫臼處死小鼠，立即摘取病變眼球，作病理活檢，行HE染色，光學顯微鏡下觀察組織學改變及真菌結構。

2 結 果

2.1 模型小鼠角膜接種后感染情況

劃痕法組 接種10μL煙曲霉孢子混懸液，含量分別為 102CFU、104CFU、106CFU、108CFU 菌液的感染率分別為 (2/10)20%、(2/8)25% 、(2/6)33.3% 、(3/6)50%。接種量 ＜106CFU時，角膜呈輕度病變，24 h內角膜基本恢復正常透明度;接種量≥106CFU時，角膜輕度混濁 (見圖1)可持續(xù)36～48 h，于10 d內基本恢復正常的透明度，部分小鼠角膜僅留下多少不等的新生血管(見圖2)。

環(huán)磷酰胺處理+劃痕法組 接種含量為106CFU時，感染率為6/6(100%)，病變中至重度(見圖3)，持續(xù)到第10天時，角膜病變持續(xù)存在(見圖4)。

角膜基質注射法組 接種含量為106CFU時，正常小鼠角膜感染率為6/6(100%)，病情中至重度 (見圖5)，病變遷延，呈現(xiàn)明顯角膜潰瘍(見圖6)。

接種生理鹽水組 角膜未呈現(xiàn)混濁，8 h內觀察僅顯示角膜表面水腫粗糙，24 h后全部角膜恢復正常。

2.2 模型小鼠角膜大體觀察結果

圖1 劃痕法:感染后第3天小鼠角膜像，顯示角膜輕度混濁 圖2劃痕法:感染后第10天小鼠角膜像，顯示角膜恢復透明，少量新生血管 圖3 CTX+化痕劃痕法:感染后第3天小鼠角膜像，顯示全角膜混濁水腫，局限潰瘍 圖4 CTX+劃痕法:感染后第10天小鼠角膜像，顯示角膜菌絲灶，較多新生血管 圖5 基質注射法:感染后第3天小鼠角膜像，顯示菌絲苔被 圖6 基質注射法:感染后第10天小鼠角膜像，顯示菌絲灶，偽足，大量新生血管Fig.1 Mouse corneal appearance by cornea sacrifiction 3 ds PI:minor opacity in the cornea Fig.2 Mouse corneal appearance by cornea sacrifiction 10 ds after inoculation:cornea regain clearing with small quantity of neovessels Fig.3 Mouse corneal appearance by sacrifiction with CTX treatment 3 ds PI:opacity and hydropswith localized ulcer in the cornea Fig.4 Mouse corneal appearance by cornea sacrifiction 10 ds after inoculation:hypha and neovessels in the cornea Fig.5 Mouse corneal appearance by stromal injection 3 ds PI:hypha mossFig.6 Mouse corneal appearance by stromal injection 10 ds PI:hypha and pseudopodia with neovessels

接種后3 d內，各組小鼠患眼畏光，刺激性眨眼次數(shù)較多。3 d后刺激癥狀漸減少至消失。感染后第7天，病情重度者角膜表面粗糙不平，壞死組織多，熒光素鈉染色陽性面積大，角膜基質層水腫明顯，有明顯新生血管，接種處有綠白色膿液及壞死物附著，質地稠厚不易刮除，即菌絲苔被;接種后第10天，各組小鼠角膜充血水腫漸減輕，遠離病灶處，角膜變得光滑平整，菌絲苔被處仍有小面積上皮缺損，熒光素染色陽性面積縮小，此時可見菌絲灶和偽足。環(huán)磷酰胺處理組中有3只小鼠在接種后表現(xiàn)納差、少動，全身毛發(fā)不順，小鼠癥狀出現(xiàn)后5 d內死亡，檢查發(fā)現(xiàn)角膜潰瘍深在且廣泛，合并前房積膿及角膜穿孔，取死亡小鼠腦部組織作真菌鏡檢及培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)顱內有廣泛的煙曲霉菌感染灶。

2.3 模型小鼠角膜實驗室檢查結果

角膜組織真菌鏡檢結果 接種后第5天，取角膜標本行真菌鏡檢，發(fā)現(xiàn)透明有隔的菌絲，呈45°分支，同時見有散在的孢子。全部模型組檢出率70%(見圖7)。

角膜組織真菌培養(yǎng)結果 見典型煙曲霉菌落，未見其他雜菌生長，光鏡下觀察見煙曲霉鏡下結構(見圖8)，證實眼部感染的病原體即為接種的標準煙曲霉菌株。全部模型組真菌培養(yǎng)陽性率100%。

組織病理學觀察結果 取病變角膜組織行HE染色見煙曲霉菌絲呈垂直的方式向角膜深層生長(見圖9，10)。

3 討 論

煙曲霉是一種廣泛存在于自然界中的一種常駐菌種，那么它對我們到底有多大的威脅呢?是否只要接觸到煙曲霉就會發(fā)生致盲性眼病或其他部位的嚴重感染呢?本實驗首先采用劃痕法比較不同濃度的煙曲霉孢子混懸液對正常小鼠角膜的感染率，發(fā)現(xiàn)隨著孢子混懸液濃度的增加其感染率增高，所致病情加重。如要確保劃痕法33%以上的正常小鼠出現(xiàn)輕至中度角膜感染，至少需要孢子混懸液的含量達到106CFU，這一現(xiàn)象說明煙曲霉性角膜炎的形成與接觸高數(shù)量的病原體直接相關。另外，我們將小鼠在實驗前用免疫抑制劑 (環(huán)磷酰胺)抑制小鼠免疫系統(tǒng)功能后，發(fā)現(xiàn)同樣接種量(106CFU)煙曲霉對小鼠角膜感染率升高到100%，且顯示更為嚴重更為持久的病變，部分小鼠發(fā)展為煙曲霉腦炎，說明煙曲霉角膜炎的形成除與病原體感染數(shù)量有關外，與受累宿主的免疫狀態(tài)也有明確關系。為了觀察角膜損傷程度與角膜真菌感染率的關系，本實驗用等量菌液(106CFU)分別采用劃痕法和角膜基質注射法造模，發(fā)現(xiàn)后者使小鼠角膜感染率更高，病變更重。由此，我們推斷出曲霉角膜炎形成的三個條件:①角膜受損并達到一定的深度，為真菌的侵襲及黏附提供了結構基礎。②入侵的病原體必須有足夠的數(shù)量才能導致曲霉角膜炎的形成。③機體免疫力降低時，角膜對曲霉的易感性增加。

圖7 小鼠角膜組織真菌鏡檢顯示透明孢子及呈45°分支的管狀菌絲(×400) 圖8 小鼠角膜真菌培養(yǎng)菌落鏡下結構，顯示煙曲霉結構(×1 000) 圖9 接種后第7天小鼠角膜組織像顯示菌絲垂直晶狀體囊生長(HE，×1 000) 圖10接種后第7天小鼠角膜組織像顯示晶狀體囊大量炎癥細胞和菌絲侵襲伴組織壞死(HE，×1 000)Fig.7 Direct light microscopic photographs of cornea tissues:clear spores and tubular-shape hypha with 45°branching(×400)Fig.8 Light microscopic photograph of fungal colony isolated from mouse cornea:the structure of Aspergillusfumigatus(×1 000)Fig.9 Mouse corneal tissue appearance 7 ds PI:hypha growth vertically to the capsula lentis(HE，×1 000)Fig.10 Mouse corneal tissue appearance 7 ds PI:large amount of inflammatory cells and hypha with necrotic tissues in the capsula lentis(HE，×1 000)

組織病理活檢在許多疾病的診斷中視為金指標，對煙曲霉角膜炎也有確診價值，但通常只用于相關的基礎研究或角膜移植術后的確診，術前組織活檢很少進行。本實驗刮取小鼠角膜病變組織行真菌鏡檢，陽性率達70%，此項檢查簡便易行，3～5 min即可出結果，且經(jīng)濟要求不高，較適合基層醫(yī)院實施開展，從而提高真菌病的早期診斷率。本次實驗通過病理組織檢查發(fā)現(xiàn)煙曲霉以垂直角膜基質層的方向向角膜深層潛行生長，而鏡檢時所取標本來自病變角膜表面的分泌物及壞死物，離真菌深層感染灶較遠，加之標本量偏少，導致其敏感性降低，鏡檢陽性率達不到100%，如在取標本做鏡檢同時取適量標本行真菌培養(yǎng)，在適宜的培養(yǎng)基中，僅一條煙曲霉菌絲片段或孢子也能無限制繁殖擴增，從而提高真菌培養(yǎng)檢查的陽性率，故臨床上如真菌鏡檢陰性，不能除外真菌感染。

系統(tǒng)性真菌感染的研究證實煙曲霉感染肺組織時，可產(chǎn)生多種水解活性酶如絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶等，這些活性酶通過降解肺泡細胞外基質從而促進煙曲霉對組織的黏附擴散［6］。另有研究證實煙曲霉感染角膜時，早期即存在煙曲霉孢子與角膜上皮基底膜的黏附現(xiàn)象。本實驗發(fā)現(xiàn)僅有菌絲或炎癥細胞侵犯處組織保持較完整，而煙曲霉與炎癥細胞同時侵犯處組織發(fā)生溶解壞死 (見圖9，10)，根據(jù)已有的研究結果和本試驗組織病理學所見，我們推測，角膜曲霉感染中，受累組織斷裂溶解是病原體和炎癥細胞綜合作用的結果:一方面煙曲霉與受累組織發(fā)生黏附產(chǎn)生機械破壞，而致病狀態(tài)的煙曲霉分泌多種水解酶及毒素，造成對組織的化學性降解破壞;另一方面入侵的煙曲霉作為異物對體內炎癥細胞產(chǎn)生趨化作用，活化的炎癥細胞也可釋放大量蛋白水解酶和炎癥介質參與對組織的溶解破壞，促進菌絲和孢子在組織中的黏附和擴散。有關曲霉角膜炎的更多損傷機制有待進一步深入的研究。

［1］ 應佳，施天嚴.真菌性角膜炎［J］.實用醫(yī)學雜志，2007，23(24):3965.

［2］ Botterel F，Gross K，Ibrahim-Granet O，et al.Phagocytosis of Aspergillus fumigatus conidia by primary nasal epithelial cells in vitro［J］.BMCMicrobiol，2008，8:97.

［3］ Wenxian Zhong，Hongmei Yin，Lixin Xie.Expression and potential role of major inflammatory cytokines in experimental keratomycosis［J］.Mol Vis，2009，15:1303-1311.

［4］ 中華人民共和國國家標準［S］.GB/T 14926.4-2001實驗動物微生物學檢測方法(2)

［5］ Wu TG，Wilhelmus KR，Mitchell BM.Experimental keratomycosis in a mouse model［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(1):210-216.

［6］ Rementeria A，Lopez-Molina N，Ludwig A，et al.Genes and molecules involved in Aspergillus fumigatus virulence［J］.Rev Iberoam Micol，2005，22(1):1-23.