喻蘇青,陳 凱,婁家豪,宋必衛(wèi),齊敏友

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 310032)

山茱萸系山茱萸科植物Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí),始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,有良好的溫腎壯陽之功,《藥性論》載:“補(bǔ)腎氣,興陽道,堅(jiān)陰莖,添精髓”.山茱萸總苷是山茱萸主要活性成分之一,可降低鏈脲佐菌素(STZ)所致糖尿病大鼠肌漿網(wǎng)鈣泵(SERCA2a)的表達(dá)[1];顯著降低大鼠血糖、糖化血清蛋白,提高肝糖原含量[2]等.山茱萸總苷的提取方法很多,如索氏提取法、超聲提取法[3]、超臨界流體萃取法[4]等.自Ganzler首次將微波輔助技術(shù)(microwave-assisted extraction,MAE)應(yīng)用于植物樣品提取,MAE技術(shù)[5-6]日趨成熟.筆者就該項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用于山茱萸總苷的微波提取工藝進(jìn)行研究,并以熊果酸為標(biāo)示量[7],HPLC法測定其含量.本實(shí)驗(yàn)提高了山茱萸總苷的提取率,建立了山茱萸總苷的微波輔助萃取工藝,操作簡單,生產(chǎn)成本降低,有利于山茱萸的開發(fā)利用.

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

島津LC-10A高效液相色譜儀(日本島津).萬能粉碎機(jī)(廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備有限公司).電子分析天平(Mettler Toledo公司).格蘭仕微波爐(格蘭仕公司).RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮儀器廠).熊果酸對照品(購自中國藥品生物制品檢定所);山茱萸藥材(購自胡慶余堂);甲醇為色譜純;水為重蒸水;其他試劑均為分析純.

1.2 山茱萸總苷含量的HPLC測定

1.2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μ m),流動(dòng)相為 V(甲醇)∶V(水)=9∶1;流速1.0 mL/min,柱溫25 ℃,檢測波長215 nm,進(jìn)樣量20 μL.

1.2.2 樣品的處理

山茱萸60℃恒溫干燥,粉碎,過60目篩,用烘箱烘至恒重保存.精密稱定樣品約3 g于250 mL錐形瓶中,分別按設(shè)定的微波提取條件安排實(shí)驗(yàn),抽濾,濾液55℃減壓濃縮得浸膏.浸膏溶于50 mL純化水,以石油醚(60～90℃)1倍量萃取 2次,再以1倍量水飽和正丁醇萃取3次,合并正丁醇萃取液,減壓濃縮至無醇味,備用.

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取干燥至恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品3.1 mg,用流動(dòng)相定容至5 mL量瓶中,即得620 μg/mL的對照品溶液.分別取5,10,15,20,25 μL的對照品溶液進(jìn)樣,按上述色譜條件進(jìn)行測定,測得峰面積.以熊果酸量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程:Y=338 883X+16 393(r=0.999 8).結(jié)果顯示 ,熊果酸在 3.10 ～ 15.50 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系.

專欄是編輯稿件的重要方式之一，地方科技期刊的編輯不僅要深入挖掘文章質(zhì)量，還要主動(dòng)向有學(xué)術(shù)影響力的作者群體約稿，準(zhǔn)確定位某一學(xué)科特點(diǎn)與熱點(diǎn)，策劃籌辦特色?？?、專欄，邀請作家專門為專欄目撰寫文章。將編輯的主動(dòng)性、創(chuàng)造性與讀者需求結(jié)合，通過?？?欄培育屬于自己的刊物特色，增強(qiáng)科技期刊的學(xué)術(shù)影響力與競爭力，打造名牌欄目、名牌期刊，占領(lǐng)學(xué)科發(fā)展高地?，F(xiàn)代化的經(jīng)營意識(shí)與學(xué)術(shù)影響力的充分結(jié)合為地方科技期刊的品牌建設(shè)注入了新的發(fā)展動(dòng)力，通過籌辦特色學(xué)科?？?專欄，擴(kuò)大期刊知名度的同時(shí)還可以提升編輯的組稿能力與專業(yè)水準(zhǔn)。[7]

將同一熊果酸對照品溶液,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次,每次20 μL,記錄峰面積.熊果酸峰面積 RSD%為1.1%(n=6),結(jié)果顯示儀器的精密度良好.

1.3.5 光波組合對山茱萸總苷提取率的影響

1)EL1262帶超采樣功能的數(shù)字量輸入模塊用于采集編碼器同步脈沖，采樣速度快，能夠滿足卷煙機(jī)生產(chǎn)速度要求；

精密稱定約20 mg浸膏,用流動(dòng)相定容至10 mL,搖勻,用0.45 μ m微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液進(jìn)樣,按外標(biāo)法測定.色譜圖見圖1.

圖1 溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of control solution(a)and sample solution(b)

1.3 微波提取的單因素實(shí)驗(yàn)

由于微波功率主要影響升溫速度,功率越大提取時(shí)環(huán)境溫度升高越快,提取效率也會(huì)相對地越高.但功率越大有機(jī)試劑也越容易沸騰,不易控制,所以選取320 W條件試驗(yàn).

由圖5可知:山茱萸總苷的含量隨著微波時(shí)間的增加而明顯升高,55%微波和45%光波時(shí)間組合時(shí)達(dá)最高值.所以選擇55%為最適微波光波時(shí)間比.

最近幾年來，湖北省把鄂州市當(dāng)作全省城鄉(xiāng)一體化的試點(diǎn)市區(qū)來進(jìn)行建設(shè)。鄂州市也充分利用了這次試點(diǎn)的機(jī)會(huì)，將構(gòu)建和諧社區(qū)作為建設(shè)的重點(diǎn)，在和諧社區(qū)建設(shè)方面取得了長足的發(fā)展，受到了湖北省委、省政府的高度贊揚(yáng)。[2]然而，鄂州市在和諧社區(qū)建設(shè)中物業(yè)管理方面仍存在一些問題，需要解決。

1.2.4 精密度測試

在提取時(shí)間分別為30,40,50,60,120,180,240 s,液固比為 25 mL/g,在功率為320 W 條件下,以95%乙醇微波提取,測定并計(jì)算提取率,見圖2.

圖2 時(shí)間對收率的影響Fig.2 Duration of microwave radiation

由圖2可以看出:在提取時(shí)間為30～60 s時(shí),提取率隨時(shí)間的延長而逐漸升高,在60 s以后基本趨于平衡.可能是因?yàn)樗碥找鸦救艹?所以增加提取時(shí)間不能使提取率升高.所以選取提取時(shí)間為60 s.

1.3.2 不同溶劑對山茱萸總苷提取率的影響

1)靶板成坑的體積Vc與彈丸的動(dòng)能Ep近似成比例關(guān)系，即,Vc≈KEp，其中K為常數(shù)，依賴于彈-靶材料的性質(zhì)。

分別以 95%乙醇、丙酮、氯仿、正丁醇、乙酸乙酯為提取液,液固比為 25 mL/g,320 W功率下微波提取60 s,測定并計(jì)算提取率,見表1.

表1 溶劑對收率的影響Table 1 Selection of solvents

由表1可知:95%乙醇和正丁醇部分皂苷收率較高.但是,正丁醇為毒性溶劑,而且沸點(diǎn)高,所以選擇相對安全而又低沸點(diǎn)的95%乙醇為提取溶劑.

根據(jù)給排水、消防、電氣等工藝專業(yè)的需求，配電裝置樓的某些部位墻體需要安裝設(shè)備箱，通常是消火栓箱、配電箱、控制箱等，消火栓箱常見最大尺寸為1 600 mm(高)×700 mm(寬)×240 mm(厚)，配電箱常見尺寸有450 mm(寬)×550 mm(高)×190 mm(深)。前文所述墻體較薄，在厚度上不能滿足箱體安裝要求，如果箱體局部突出墻體，既不美觀又存在安全隱患，所以，安裝有箱體的隔墻優(yōu)化設(shè)計(jì)為雙排龍骨，將箱體內(nèi)嵌于墻體中間。箱體安裝處往往埋管密集，經(jīng)細(xì)化設(shè)計(jì)后，墻體即可滿足箱體安裝要求，又可在雙排龍骨空隙中埋管，也避免了埋管過多對單層龍骨整體性的破壞。

1.3.4 液固比對山茱萸總苷提取率的影響

在乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為30%,50%,70%,80%,95%,99%,液固比為25 mL/g,提取時(shí)間為1 min的條件下進(jìn)行微波提取,測定并計(jì)算提取率,見圖3.

當(dāng)收貨員收完貨貼好標(biāo)簽后，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)環(huán)節(jié)。這一過程是叉車司機(jī)按照系統(tǒng)所給的信息將貨物放入相對應(yīng)的貨槽中。但在中途會(huì)發(fā)生一些錯(cuò)失，如：將貨物放在相鄰的位置，而不是正確的貨槽里；標(biāo)簽有所遺失，導(dǎo)致該貨物成為無信息貨物，無法第一時(shí)間放入正確的貨槽中。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對收率的影響Fig.3 Concentration of ethanol

5、加強(qiáng)田間管理：大豆發(fā)生根腐病，主要是根的外表皮（切皮部）完全腐爛，影響對水分、養(yǎng)分的吸收。因此，及時(shí)趟地培土到子葉節(jié)能使子葉下部長出新根，使新根迅速吸收水分和養(yǎng)分，緩解病情，這是治療大豆根腐病的一項(xiàng)有效農(nóng)業(yè)措施。

1.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對山茱萸總苷提取率的影響

由圖3可知:山茱萸總苷的含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而逐步上升.由于無水乙醇價(jià)格相對較高,為了節(jié)約成本,選擇95%乙醇為提取溶劑.

因溶劑太少無法浸沒物料,所以選擇在料液比為10,15,20,25,30 mL/g,乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%,功率為320 W,提取時(shí)間為60 s的條件下進(jìn)行提取,測定并計(jì)算提取率,見圖4.

圖4 液固比對收率的影響Fig.4 Solvent to material ratio

由圖4可知:總苷收率隨著液固比的增加而升高,當(dāng)超過20 mL/g時(shí),收率明顯下降.因此選取20 mL/g為最佳液固比.

1.2.5 樣品的測定

在功率為320 W,20 mL/g的95%乙醇,微波光波時(shí)間比值分別為100∶0,55∶45,30∶70,0∶100的條件下,提取1 min,測定并計(jì)算提取率,見圖5.

圖5 微波與光波的時(shí)間比值對收率的影響Fig.5 Light/wave time ratio

1.3.1 微波萃取時(shí)間對山茱萸總苷提取率的影響

1.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化微波提取工藝

在微波單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對影響山茱萸總苷提取率的主要因素乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波提取時(shí)間以及微波光波時(shí)間比值進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),設(shè)計(jì)見表2,結(jié)果見表3.

表2 正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表Table 2 Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of L9(34)orthogonal test

由表4可知:采用微波提取法提取山茱萸總苷,液固比和時(shí)間對提取率有顯著影響,光波比和乙醇體積分?jǐn)?shù)沒有顯著性.根據(jù)極差R值可以得出,4個(gè)因素對山茱萸總苷提取率影響的主次順序?yàn)镃＞A＞D＞B,最優(yōu)水平為 C3A1D2B2,即液固比25 mL/g,50 s,55%光波組合,70%乙醇.通過試驗(yàn)證實(shí)在該條件下總苷提取率為3.02 mg/g.

表4 正交試驗(yàn)方差分析表Table 4 Analysis of variance about total extraction rate

1.4 最佳條件下的重復(fù)性和回收率實(shí)驗(yàn)

1.4.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

我盯著手里的武器，在我的人生中，從沒有料到會(huì)握著一把槍，更別說射擊了。我感覺這很危險(xiǎn)，好像只是碰著它，就可能隨時(shí)走火傷及他人。

文道、技道關(guān)系決定作品價(jià)值和作者人生境界的高下，這是陸游否定晚唐詩的根本理論依據(jù)；而指晚唐詩“(詩格)卑弱”，也正是責(zé)晚唐詩人人格的卑弱。實(shí)際上都未出儒家正統(tǒng)詩學(xué)觀的范圍。他在《答陸伯政上舍書》中曾說：“古聲不作久矣！所謂詩者，遂成小技；詩果可謂之小技乎？學(xué)不通天人，行不能無愧于俯仰，果可言詩乎？”〔1〕74陸游也認(rèn)為：“大抵詩欲工，而工亦非詩之極也。鍛煉之久，乃失本旨；斲削之甚，反傷正氣。”〔1〕244這也是他否定晚唐詩的詩學(xué)理由。亦基于此，他才會(huì)說“亦莫雕肝肺，吟哦學(xué)郊島”(《晨起》)，“晚唐諸人戰(zhàn)雖鏖，眼暗頭白真徒勞”(《記夢》)！

取同一批次的山茱萸樣品5份,在最佳條件下進(jìn)行萃取,分別測定各自的總苷含量,結(jié)果表明其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.68%.

1.4.2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

收到U盤的程瀚大為光火，立即指示市公安局副局長張某不辦立案手續(xù)、直接動(dòng)用技偵手段追查此事。令人咋舌的是，負(fù)責(zé)處理這個(gè)案件的一名女警就是視頻中的“女主角”。

準(zhǔn)確稱取一定量樣品9份,加入不同量的熊果酸對照品溶液,在最佳條件下進(jìn)行萃取,萃取物按試驗(yàn)方法進(jìn)行顯示,測定峰面積,計(jì)算回收率.結(jié)果表明回收率在99%～102%之間,說明此方法有較好的準(zhǔn)確度.

1.5 微波法與傳統(tǒng)提取方法的比較

本實(shí)驗(yàn)用乙醇浸提法和超聲波萃取法進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn).乙醇浸提法:液固比25 mL/g,95%乙醇磁力攪拌下浸泡48 h,過濾,取濾液,連續(xù)提取3次,合并濾液,減壓濃縮.共萃取3次,計(jì)算平均提取率.超聲波輔助提取法:液固比30 mL/g,95%乙醇,45 kHz頻率,超聲萃取15 min.共萃取3次,得平均提取率.以上各種萃取方法結(jié)果對比列于表5中,可以看出,微波提取法僅用1 min卻比乙醇浸提48 h的提取率高.從節(jié)能、省時(shí)和試劑節(jié)約等多方面角度看,微波法優(yōu)于乙醇浸提法和超聲波萃取法.

表5 與其它提取方法的比較Table 5 Comparison of MAE with other extraction methods

2 結(jié) 論

主要對微波輔助法萃取山茱萸總苷進(jìn)行了初步研究,正交試驗(yàn)表明:影響山茱萸總苷提取率的主要因素為液固比和時(shí)間.在功率300 W條件下,最佳提取工藝條件:液固比 25 mL/g,提取時(shí)間50 s,微波光波時(shí)間比值55%,乙醇體積分?jǐn)?shù)70%,該條件下總苷提取率為3.02 mg/g.由重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)和加樣回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出,建立的萃取和測定方法可靠、準(zhǔn)確及簡便.微波輔助萃取與乙醇浸提法的比較表明:微波輔助法具有快捷、高效和節(jié)能等特點(diǎn),說明工藝可行.

[1] QI Min-you,LIU Hao-ran,DAI De-zai,et al.Total triterpene acids,active ingredients from Fructus Corni,attenuate diabetic cardiomyopathy by normalizing ET pathway and expression of FKBP12.6 and SERCA2a in streptozotocin-rats[J].Journal of pharmacy and pharmacology,2008,12:1687-1690.

[2] WEI Zhang,DI Hong,ZHOU Yan,et al.Ursolic acid andits derivative inhibit protein tyrosine phosphatase 1B,enhancing insulin receptor phosphorylation and stimulating glucose uptake[J].Biochimicaet Biophysica Acta,2006,1760(10):1505-1512.

[3] 張如新,羊衛(wèi)平,樊勤.超聲波法提取山茱萸中熊果酸的工藝研究[J].湖南師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,31(3):31-34.

[4] 韓志慧,陳俊英,張景偉,等.超臨界CO2萃取山茱萸中熊果酸的研究[J].中草藥,2005,36(8):1159-1162.

[5] 張帆,齊小花,鄒明強(qiáng),等.微波輔助萃取——分光光度法測定細(xì)梗胡枝子葉中總黃酮的含量[J].時(shí)針國醫(yī)國藥,2009,20(6):1323-1324.

[6] CHEN Yi,XIE Ming-y ong,GONG Xiao-feng.Microwave-assisted extraction used for the isolation of total triterpenoid saponins from Ganoderma atrum[J].Journal of Food Engineering,2007,81:162-170.

[7] 李欣孺,趙峰,龍偉,等.山茱萸總皂苷的大孔吸附樹脂分離與純化研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2009,28(6):767-770.