文 潔， 朱建梅， 李 婕， 袁廣明， 向飛軍

(1.中山大學(xué)藥物開發(fā)中心，廣東 廣州 510080;2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510080;3.廣東環(huán)球制藥有限公司，廣東順德 528000)

玉屏風(fēng)散［1］由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)三味中藥組成，可益氣固表，是中醫(yī)的經(jīng)典方。本研究通過建立卵蛋白致大鼠和豚鼠過敏性鼻炎模型［2］，探討玉屏風(fēng)顆粒對(duì)過敏性鼻炎的治療作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量150～250 g，合格證號(hào):粵監(jiān)證字2008A011;豚鼠，雌雄各半，350 ～450 g，合格證號(hào):粵監(jiān)證字2007A051，普通級(jí)。均購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物和試劑 玉屏風(fēng)顆粒，廣東環(huán)球制藥有限公司，批號(hào):081105，實(shí)驗(yàn)時(shí)按需要配制成1/3臨床用劑量、臨床用劑量及三倍臨床用劑量3種濃度藥液備用。鼻炎康片，佛山德眾藥業(yè)有限公司，批號(hào):08218，每片重0.37 g(含馬來酸氯苯那敏1 mg)。吸附無細(xì)胞白百破聯(lián)合疫苗，成都生物制品研究所，規(guī)格0.5 mL/支，批號(hào):20071013-1。卵蛋白片，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào):F20070827。伊文斯藍(lán)，批號(hào)e-2129，進(jìn)口分裝，Sikema公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 對(duì)卵蛋白致大鼠過敏性鼻炎的治療作用 參照文獻(xiàn)［3-4］并改進(jìn)，建立大鼠過敏性鼻炎模型:大鼠前肢和后肢跖，分別注射0.1 mL 1%卵蛋白(OVA)生理鹽水液和0.2 mL白百破聯(lián)合疫苗;5 d后以0.5%OVA生理鹽水液1 mL注入大鼠背部。初次致敏后第7天開始，1%OVA滴鼻激發(fā)，10 μL/(次·d)，維持到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每7天記錄一次1%OVA滴鼻后大鼠撓鼻、噴嚏次數(shù)及清涕出現(xiàn)的輕重程度，觀察時(shí)間為30 min。用PCA試驗(yàn)檢測(cè)IgE抗體效價(jià):致敏后第14天，從同致敏天數(shù)各組動(dòng)物中分別各取2只大鼠腹腔靜脈采血，離心分離得血清，并按1∶1、1 ∶16、1 ∶18 比例稀釋，分別取 0.1 mL上述稀釋好的各種血清注射于正常未致敏大鼠背部皮內(nèi)。48 h后，尾靜脈注射1 mL含1 mg卵蛋白和10 mg伊文思藍(lán)的生理鹽水溶液，30 min后處死大鼠，剝離背部皮膚，測(cè)量藍(lán)色斑點(diǎn)直徑，大于5 mm判定為陽性。于致敏后第21天、第28天、第35天，分別按上述操作重復(fù)進(jìn)行一次，以判定實(shí)驗(yàn)過程中各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中IgE抗體效價(jià)的變化。致敏后第14天，選取鼻炎癥狀積分3分以上大鼠，隨機(jī)分成6組，每組12只。分別為模型組、玉屏風(fēng)顆粒高、中、低劑量組，鼻炎康(陽性對(duì)照)組。另設(shè)正常組大鼠12只，給予同容積飲用水，雙側(cè)鼻孔滴入生理鹽水。各組均在OVA滴鼻前1 h灌胃給藥，共給藥3周。在OVA滴鼻30 min內(nèi)觀察鼻炎癥狀，記錄撓鼻、噴嚏次數(shù)及清涕出現(xiàn)的輕重程度，每7天觀察一次。用積分迭加法評(píng)分(撓鼻:抓撓3次為1分，3～10次2分，抓撓不止3分;噴嚏:1～3個(gè)為1分，3～5個(gè)2分，連續(xù)噴嚏3分;清涕:流到鼻前孔1分;超過鼻前孔2分;涕流滿面3分)。

2.2 對(duì)卵蛋白致豚鼠過敏性鼻炎的治療作用 參照文獻(xiàn)［4-6］并改進(jìn)，建立豚鼠過敏性鼻炎模型:豚鼠兩后肢四頭肌，分別注射5%卵蛋白(OVA)生理鹽水液各0.4 mL，腹腔注射5%OVA 1 mL。初次致敏后第7天開始，2.5%OVA 滴鼻激發(fā)，10 μL/(次·d)，維持至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。致敏后第14天，根據(jù)鼻炎癥狀選取合格豚鼠隨機(jī)分成5組，每組10只。分別為模型組、玉屏風(fēng)顆粒高、中、低劑量組，鼻炎康(陽性對(duì)照)組。另設(shè)正常組豚鼠10只，給予同容積飲用水，雙側(cè)鼻孔滴入生理鹽水。各組均在OVA滴鼻前1 h灌胃給藥，共給藥兩周。

對(duì)各給藥組流清涕動(dòng)物進(jìn)行計(jì)數(shù)，每天1次，按癥狀好轉(zhuǎn)率評(píng)分，比較組間差異。各組動(dòng)物總數(shù)—流清涕動(dòng)物數(shù)/各組動(dòng)物總數(shù) ×100%=癥狀好轉(zhuǎn)率。連續(xù)給藥第10天后，將各實(shí)驗(yàn)組豚鼠缺氧處死一半;給藥后第14天，處死剩余的一半;取動(dòng)物鼻中隔黏膜組織，每組還各取2只豚鼠肺下葉組織，經(jīng)脫鈣、脫水包埋、染色切片。鏡下觀察所有實(shí)驗(yàn)組豚鼠鼻黏膜的嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴漿細(xì)胞浸潤、腺體增生以及柱狀上皮鱗化程度、支氣管周圍、肺組織炎性病變情況，用迭加法計(jì)算各組病理觀察平均積分。

3 結(jié)果

3.1 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)OVA所致大鼠過敏性鼻炎的作用

3.1.1 鼻炎癥狀 從初次致敏第7天開始，抗原攻擊后動(dòng)物撓鼻、噴嚏的次數(shù)，流清涕程度逐天增加，卵蛋白致敏第14天，動(dòng)物造模成功(P＜0.01)。將造模成功的動(dòng)物隨機(jī)分為6組給藥。用藥第7天，玉屏風(fēng)中劑量、低劑量組鼻炎癥狀反應(yīng)有明顯改善(P＜0.01、P＜0.05);用藥第14 天，玉屏風(fēng)中劑量組可明顯改善鼻炎癥狀(P＜0.01)，玉屏風(fēng)高、低劑量組鼻炎癥狀積分有減輕趨勢(shì);用藥第21天，各給藥組鼻炎癥狀與模型組比較仍有減輕趨勢(shì)，但已無顯著性差異(P＞0.05)見表1。

3.1.2 IgE抗體水平變化 致敏后第14天，造模動(dòng)物血清樣本IgE抗體均呈陽性反應(yīng)，皮內(nèi)藍(lán)斑均＞5 mm，血清IgE抗體達(dá)到最高值。用1%OVA滴鼻每天激發(fā)，在14～28 d之間能基本維持穩(wěn)定的IgE抗體效價(jià)1∶1、1∶6、1∶18以及鼻炎癥狀，而正常組動(dòng)物始終沒能檢測(cè)出IgE。用藥后7 d，模型對(duì)照組血清樣本IgE抗體效價(jià)范圍在1∶1～1∶18;而玉屏風(fēng)顆粒治療組隨著給藥時(shí)間增加，IgE抗體滴度降低，效價(jià)范圍在1∶1～1∶6內(nèi)，1∶18抗血清樣本呈陰性。用藥后14 d，模型對(duì)照組與玉屏風(fēng)顆粒治療組血清樣本效價(jià)范圍均為1∶1～1∶6。

3.2 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)OVA致豚鼠過敏性鼻炎的作用

3.2.1 鼻炎癥狀 從初次致敏第7天開始，抗原攻擊后動(dòng)物撓鼻、噴嚏的次數(shù)，流清涕程度逐天增加，在OVA致敏第14天，挑選造模成功動(dòng)物隨機(jī)分為6組后開始給藥。各治療組鼻炎癥狀隨給藥時(shí)間增加逐漸減輕，好轉(zhuǎn)率逐漸提高。給藥第4天開始，玉屏風(fēng)高、中、低劑量組及鼻炎康組癥狀好轉(zhuǎn)率開始明顯上升;給藥第6天，玉屏風(fēng)中、低劑量組鼻炎癥狀明好轉(zhuǎn)率均﹥70%;給藥第10天時(shí)，玉屏風(fēng)中、低劑量組鼻炎癥狀好轉(zhuǎn)率均﹥80%以上;在連續(xù)給藥14 d后，組間方差分析結(jié)果顯示，與模型對(duì)照組比較，玉屏風(fēng)中劑量組、鼻炎康陽性組均有顯著性差異，P＜0.05，F(xiàn)=3.45。見圖1。

圖1 豚鼠鼻炎癥狀組間好轉(zhuǎn)率比較Fig.1 The improvement rate of allergic rhinitis symptoms

3.2.2 鼻黏膜組織學(xué)觀察 正常組動(dòng)物幾乎無鼻黏膜嗜酸細(xì)胞(EOS)浸潤，經(jīng)反復(fù)給予OVA抗原攻擊后，模型組鼻黏膜潰瘍、腺體增生以及充血水腫比較明顯，尤以EOS浸潤明顯增多(P＜0.01)，表明EOS浸潤在OVA過敏性鼻炎模型發(fā)病機(jī)理中起重要作用。連續(xù)給藥10 d后，玉屏風(fēng)中、低劑量組上述病理學(xué)特征得到明顯改善(P＜0.01、P＜0.05)，改善效果呈正相關(guān)(P＜0.05)。連續(xù)給藥14 d后，各實(shí)驗(yàn)組病理學(xué)改變與模型對(duì)照組比較已無顯著性差異(P＞0.05)。對(duì)模型對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組豚鼠肺組織、支氣管周圍組織學(xué)觀察，未發(fā)現(xiàn)EOS增多，上皮細(xì)胞增生，肺泡間隔變窄，局部充血等病理學(xué)改變。表明經(jīng)鼻腔的抗原激發(fā)方式，使變態(tài)反應(yīng)局限于豚鼠的鼻腔。見表2、圖2。

4 討論

變應(yīng)性鼻炎又稱過敏性鼻炎［7］，是以突發(fā)性及反復(fù)發(fā)作的鼻癢、噴嚏、鼻分泌亢進(jìn)、鼻黏膜腫脹為主要癥狀特點(diǎn)的一種變態(tài)反應(yīng)疾病，屬中醫(yī)“鼻鼽”范疇，為耳鼻喉科常見病、多發(fā)病。過敏性鼻炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其中鼻黏膜嗜酸細(xì)胞(EOS)浸潤是過敏性鼻炎的重要病理學(xué)特征。近年來，致敏原檢測(cè)及全身免疫功能調(diào)節(jié)在臨床診斷和治療中受到重視，并開始選用相應(yīng)藥物用于臨床治療。

玉屏風(fēng)散出自元·朱丹溪的《丹溪心法》，是益氣固本之經(jīng)典方，其所治病證“肺氣虛證”既是變應(yīng)性鼻炎的臨床常見證型之一，也是臨床各型變應(yīng)性鼻炎患者長期反復(fù)發(fā)作后形成的易感體質(zhì)——肺氣虧虛體質(zhì)［8］?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，玉屏風(fēng)散對(duì)免疫系統(tǒng)效應(yīng)較為肯定，不僅對(duì)體液免疫(使IgA、IgG升高，使IgE降低)、單核巨嗜細(xì)胞系統(tǒng)、T淋巴細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的增強(qiáng)作用，而且對(duì)紅細(xì)胞免疫也有增強(qiáng)作用［9-10］。本實(shí)驗(yàn)通過玉屏風(fēng)顆粒對(duì)大鼠和豚鼠兩種過敏性鼻炎動(dòng)物模型治療作用研究表明，玉屏風(fēng)顆?？擅黠@改善大鼠和豚鼠的過敏反應(yīng)，表現(xiàn)為血清IgE水平降低，過敏性鼻炎癥狀顯著緩解，使豚鼠鼻黏膜EOS浸潤減輕，鼻黏膜潰瘍、腺體增生以及充血水腫得到明顯改善，提示玉屏風(fēng)顆?？赏ㄟ^扶正脫敏，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)著手治療過敏性鼻炎，有著很好的臨床應(yīng)用前景。

表2 OVA豚鼠過敏性鼻炎模型病理觀察評(píng)分(給藥10 d后，n=5)Tab.2 The nasal pathological changes of the guinea pig allergic rhinitis models

圖2 鼻黏膜組織學(xué)觀察Fig.2 The nasal pathological change of the guinea pig allergic rchinitis models

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