李 力， 張振秋， 王 冰， 鄧雪男

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連 116600)

木香為菊科植物木香Aucklandiae lappaDecne的干燥根［1］，《神農(nóng)本草經(jīng)》列為上品［2］，其性溫，味辛、苦，歸脾、胃、大腸、膽、三焦經(jīng)，具有行氣止痛、健脾消食的功效［3-4］。木香中主要含倍半萜內(nèi)酯類(lèi)化合物［5-7］，其中木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯的量較高［8］，二者的藥理活性明顯［9］。目前對(duì)木香的質(zhì)量研究中仍未見(jiàn)其HPLC指紋圖譜的相關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法構(gòu)建不同來(lái)源木香藥材的指紋圖譜，對(duì)10批木香藥材進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)，為整體控制和評(píng)價(jià)木香藥材的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 美國(guó)Agilent 1100 Series高效液相色譜儀(四元梯度泵，在線真空脫氣機(jī)，儀器編號(hào):20041191 DE43607375);G1314-A紫外檢測(cè)器;AS3120A超聲波清洗器;AR2140電子分析天平(上海奧豪斯公司);202-2型干燥箱(上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠);METTLER AB135-S十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士)。

1.2 試藥 木香烴內(nèi)酯對(duì)照品(批號(hào):111524-200503)，由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供;甲醇為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。木香藥材樣品共10批，分別來(lái)源于全國(guó)10個(gè)地區(qū)，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定，為菊科植物木香Aucklandiae lappaDecne的干燥根，藥材來(lái)源見(jiàn)表1。

樣品編號(hào) 來(lái)源 收集年月S1 廣東(廣州采芝林藥業(yè))2009-09 S2 上海(童涵春堂藥業(yè)) 2009-09 S3 山東(長(zhǎng)清醫(yī)藥公司) 2009-10 S4 江蘇(南京老百姓藥房) 2009-10 S5 黑龍江(寶豐藥房) 2009-10 S6 四川(成都) 2009-11 S7 遼寧(沈陽(yáng)紅太陽(yáng)藥房) 2009-11 S8 北京(同仁堂) 2009-09 S9 河北(安國(guó)) 2009-09 S10 云南(昆明)2009-10

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Phenomsil ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相:甲醇(A)-水(B)梯度洗脫，體積流量1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量10 μL，梯度洗脫程序見(jiàn)表 2，所有組分均在70 min內(nèi)被洗脫。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.2The schedules of mobile phase gradient elution

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取木香烴內(nèi)酯對(duì)照品1.98 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.079 2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取木香樣品粗粉0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，搖勻，稱定質(zhì)量，放置過(guò)夜，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取同一木香藥材供試品溶液(樣品號(hào)10)，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的一致性，結(jié)果其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積 RSD 分別為 0.02% ～0.23% 和 0.22% ～1.9%，說(shuō)明儀器精密度良好，符合指紋圖譜測(cè)定的要求［10-11］。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一木香藥材供試品溶液(樣品號(hào)10)，按2.1 項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD分別為0.02% ～2.6%和1.5%～2.7%，說(shuō)明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批木香藥材粗粉(樣品號(hào)10)6份，按2.3項(xiàng)下供試品溶液的處理方法平行制得6份供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明重復(fù)性好。

2.5 樣品指紋圖譜測(cè)定 分別取來(lái)自10個(gè)不同來(lái)源的木香樣品，按2.3項(xiàng)下供試品溶液制備方法得供試品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄HPLC圖。比較不同來(lái)源樣品的色譜圖，其中13個(gè)色譜峰為10批樣品的共有峰，確定為共有指紋峰，其中9號(hào)峰為木香烴內(nèi)酯色譜峰，選作參照峰，設(shè)其保留時(shí)間和峰面積分別為1，其他各共有峰的保留時(shí)間和峰面積分別與參照峰的保留時(shí)間和峰面積相比，計(jì)算各樣品指紋圖譜中共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果分別見(jiàn)圖 1、2、3，表 3、4。

圖1 木香烴內(nèi)酯對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of costunolide

圖2 10個(gè)木香樣品的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 10 samples

圖3 木香藥材的HPLC指紋共有模式Fig.3 HPLC fingerprint mutual mode of Aucklandiae Radix

2.6 指紋圖譜的相似度計(jì)算［12］運(yùn)用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版對(duì)10批木香藥材的指紋圖譜進(jìn)行了相似度分析，將色譜工作站的數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，選定上述13個(gè)特征峰進(jìn)行譜峰匹配，通過(guò)中位數(shù)矢量計(jì)算得出木香樣品指紋圖譜的共有模式，并依此共有模式為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評(píng)價(jià)。從表5可以看出，10批木香藥材的相似度均大于0.90，說(shuō)明各地區(qū)的樣品色譜模式相似，其化學(xué)成分一致性較好。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

3.1 樣品處理方法的考察 考察了超聲、回流、冷浸等提取方法，其中超聲提取的樣品圖譜雜質(zhì)干擾少、色譜峰基線分離好，故選用超聲提取法提取。提取溶劑分別用甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯超聲提取30 min，結(jié)果表明甲醇提取雜質(zhì)少、提取完全，故選擇甲醇作為提取溶劑。分別超聲提取15 min、30 min、45 min，結(jié)果隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，色譜峰的面積有所增大，超聲提取30 min時(shí)提取較完全，超聲45 min提取所得的峰面積有所減小，所以提取時(shí)間選擇超聲30 min。

表3 10批木香藥材的相對(duì)保留時(shí)間Tab.3 Relative retention time of 10 samples

表4 10批木香藥材的相對(duì)峰面積Tab.4 Relative peak areas of 10 samples

表5 木香樣品指紋圖譜相似度分析結(jié)果Tab.5 Similarity analysis results of Aucklandiae Radix

3.2 色譜條件的選擇 試驗(yàn)過(guò)程中選擇了多種流動(dòng)相系統(tǒng)(等度洗脫，梯度洗脫):甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水(0.05%)等流動(dòng)相系統(tǒng)洗脫，并對(duì)梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明以甲醇-水系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)所確定的梯度程序使各色譜峰達(dá)到基線分離，峰型對(duì)稱，分離較好，保留時(shí)間適中。實(shí)驗(yàn)比較了20℃、30℃、40℃ 3個(gè)不同柱溫，發(fā)現(xiàn)隨柱溫上升各色譜峰保留時(shí)間提前，在40 min后出現(xiàn)的色譜峰變化幅度較大，在30℃時(shí)檢測(cè)相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，因此選擇30℃為指紋圖譜的檢測(cè)柱溫。

3.3 從不同來(lái)源木香藥材的指紋圖譜中可以看出，各特征峰的相對(duì)保留時(shí)間相似度較高，可用于木香藥材的圖譜鑒別，但峰面積比值不盡相同，差異較大，說(shuō)明木香藥材的質(zhì)量受地理環(huán)境和氣候條件影響較大，因此木香藥材生產(chǎn)必須固定地區(qū)，才能確保其質(zhì)量的穩(wěn)定可控。

3.4 10批木香藥材指紋圖譜的相似度均在0.90以上，說(shuō)明按本方法進(jìn)行指紋圖譜分析，其相似性良好。所建立的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照色譜指紋圖譜，峰的數(shù)目、強(qiáng)度及分離度均較理想，滿足了指紋圖譜的要求，并且通過(guò)方法學(xué)考查試驗(yàn)驗(yàn)證，本試驗(yàn)具有較好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性，所以本方法可對(duì)木香藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。

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