方文娟， 余璐堯， 李大鵬， 黃金活， 呂俊華*

（1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510665；2.暨南大學藥學院藥理教研室廣東廣州510632；3.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510130）

馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞bcl-2和bax mRNA表達的影響

方文娟1， 余璐堯2， 李大鵬3， 黃金活3， 呂俊華2*

（1.無限極（中國）有限公司，廣東廣州510665；2.暨南大學藥學院藥理教研室廣東廣州510632；3.廣州市中醫(yī)醫(yī)院，廣東廣州 510130）

目的 探討馬紅丸（馬錢子、紅娘子、全蝎等）含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞bcl-2和bax mRNA表達的影響。方法 采用血清藥理學方法制備馬紅丸（MHP）和阿霉素（ADM）含藥血清以及對照血清，作用于smmc-7721細胞。MTT法檢測含藥血清對smmc-7721細胞增殖的影響；測定含藥血清對smmc-7721細胞乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量；流式細胞術檢測細胞凋亡率；RT-PCR檢測含藥血清對smmc-7721細胞bcl-2mRNA和bax mRNA表達的影響。結果 30%體積的馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于smmc-7721細胞72 h，明顯抑制細胞的增殖（P＜0.01），培養(yǎng)液中LDH的釋放量和細胞凋亡率明顯高于空白血清組（P＜0.01），bcl-2 mRNA表達下降，bax mRNA表達升高（P＜0.01）。結論 30%馬紅丸含藥血清作用于人肝癌smmc-7721細胞72 h，可明顯抑制細胞的增殖，并誘導細胞凋亡，其機制可能與抑制細胞中bcl-2 mRNA表達，促進bax mRNA表達有關。

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馬紅丸；血清藥理學；人肝癌smmc-7721細胞；凋亡

原發(fā)性肝癌（Primary Liver Cancer，PLC）的發(fā)病率和死亡率一直位居惡性腫瘤的前位，對人類健康危害極大，也是國內外醫(yī)藥學界研究的重點之一［1］。馬紅丸是以馬錢子（Semen strychni）、紅娘子（Huechys sanguinea）、全蝎（Scorpio）、川足（Scolopendra subspinipes）、守宮（Gekko japonicus Dumeril et Bibron）、生甘草（Glycyrrhizae Radix）、糯米粉等組成的用于治療腫瘤的純中藥復方制劑，臨床上對原發(fā)性肝癌、胃癌等多種腫瘤具有良好的療效［2-3］。為了探討馬紅丸抑制腫瘤的可能作用機制，利用含藥血清的制備方法［4］制備馬紅丸含藥血清，培養(yǎng)人肝癌smmc-7721細胞，探討馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞的抑瘤作用以及對bcl-2和bax mRNA表達的影響。

1 實驗材料

1.1 動物 健康清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質量為200 g左右。由廣東省實驗動物中心提供。許可證號為：SCXK（粵）2008-0002。

1.2 細胞 人肝癌smmc-7721細胞，購于中山大學動物實驗中心細胞庫。

1.3 主要儀器與藥品

1.3.1 主要儀器 熒光顯微鏡（日本Olympus公司），Tecan Safire2型全波長多功能酶標儀（瑞士Tecan公司），NANODROP 1000 spectrophotometer（美國Thermo公司），FACSCalibur型流式細胞儀（美國Becton Dickinson公司），Minicycle（美國 Bio-Rad，MJ Rearch公司），DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠），凝膠成像系統(tǒng)（英國SynGene公司）。

1.3.2 藥品 馬紅丸：丸劑，廣州市中醫(yī)醫(yī)院院內制劑；阿霉素（注射用鹽酸多柔比星）：粉針劑，浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號081004A。

1.4 試劑 四甲基偶氮唑鹽（MTT）（美國Sigma公司），乳酸脫氫酶（LDH）檢測測定試劑盒（20090316）（南京建成生物工程研究所），Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（090713）（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），瓊脂糖粉（法國Biowest公司），M-MLV反轉錄試劑盒（美國Promega公司），Trizol細胞裂解液（1382739），bax、bcl-2及 GAPDH引物（美國invitrogen公司），2×Taq PCR Green Mix（西安舟鼎國生物技術有限責任公司），Nucleic Acid Stain，100bp DNA Ladder II，DTT，DEPC 水（北京普博欣生物技術有限責任公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) smmc-7721細胞用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37°C、5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。

2.2 含藥血清的制備［4］健康清潔級SD大鼠隨機分為空白對照組、馬紅丸組及阿霉素組，馬紅丸組給藥劑量為22.75 g/kg，阿霉素組給藥劑量為1.27 mg/kg，空白對照組給予等體積生理鹽水。每天2次，每次間隔12 h，連續(xù)3 d，給藥前4 h禁食不禁水。末次灌胃1 h后，3%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血，室溫下靜置4 h，3 000 r/min離心15 min分離血清，經56 °C、30 min 滅活處理后，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌，分裝于2 mL EP管中，置-20°C保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 MTT法 以2×104/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，細胞繼續(xù)生長24～36 h后，用體積分數分別為10%、20%、30%的空白血清，馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于細胞，以正常條件培養(yǎng)的細胞做為對照，每組4個復孔。含藥血清分別作用細胞24、48、72 h后，吸去舊培養(yǎng)基，換以新鮮無血清培養(yǎng)基90 μL，并加入5 g/L 的 MTT 10 μL，繼續(xù)孵育4 h。4 h后棄去上清，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min，待藍紫色結晶充分溶解，于570 nm波長處用酶標儀測定各孔吸光度值。

2.4 LDH測定 用30%空白血清，馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于細胞后，去培養(yǎng)液上清，按試劑盒說明書操作。

2.5 細胞流式法測定細胞凋亡 以4×104/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，細胞繼續(xù)生長24～36 h后，用30%空白血清、馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于細胞，以正常條件培養(yǎng)的細胞做為對照。收集細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌細胞一次，用0.25%的胰酶消化細胞。將消化下來的細胞加入收集的細胞培養(yǎng)液中，混勻，2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL binding buffer，重懸細胞。加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，再加入5 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。1 h內上流式細胞儀檢測。Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

2.6 RT-PCR法 以4×104/mL的密度接種于6孔板中，每孔2 mL，讓細胞生長24～36 h后，用30%空白血清，馬紅丸和阿霉素含藥血清作用于細胞，以正常條件培養(yǎng)的細胞做為對照。（1）Trizol法提取細胞內總RNA；（2）測定RNA濃度：從提取的RNA中取出2 μL，于NANODROP 1000型微量分光光度計上測定280 nm及260 nm處的吸光度；（3）逆轉錄：按promega公司提供的試劑盒說明書加入各組分，采用10 μL逆轉錄反應體系，于PCR儀上70 °C，孵育5 min后，再42 °C孵育1 h，放 -20 °C保存?zhèn)溆?；?）PCR過程：按順序加入各組分，采用25 μL反應體系，于PCR儀上進行擴增。反應參數如下：bcl-2 94 °C 5 min；94 °C 45 s，64 °C 45 s，72 °C 2 min，循環(huán)35次；72 °C 7 min；bax及GAPDH：94°C 7 min；94 °C 1 min，60 °C 45 s，72 °C 45 s，循環(huán) 35 次；72 °C 10 min。bcl-2 引物：上游5＇-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3＇，下游 5＇-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3＇，擴增產物 318bp；bax引物：上游-5＇-TCCACCAAGAAGCTG AGCGAG-3 ＇，下 游 5 ＇-GTCCAGCCCATGATGGCCT-3＇，擴增產物 257bp；GAPDH引物：上游 5＇-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3＇，下游5＇-TCCAGGGGTCTACTCCTG-3＇，擴增產物 512bp；（5）擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，用Bio-Rad Quantity One軟件對電泳條帶進行掃描和光密度分析。

3 實驗結果

3.1 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞增殖的影響

30 %馬紅丸含藥血清及阿霉素含藥血清作用于smmc-7721細胞24 h和72h時，與空白血清組比較，明顯抑制細胞增殖的作用 （P＜0.01），以72h抑瘤作用更為明顯，故后續(xù)實驗均以72 h作為抑瘤時間。見表1。

表1 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞增殖的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of Mahong Pill containing serum on the proliferation of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=6）

表1 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞增殖的抑制作用（±s，n=6）Tab.1 Inhibitory effect of Mahong Pill containing serum on the proliferation of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=6）

與空白血清組比較，##P＜0.01；與24 h抑制率比較＊＊P＜0.01。##P＜0.01 vs blank serum group；＊＊P＜0.01 vs 24 h group.

組別24 h OD 抑制率/%48 h OD 抑制率/%72 h OD 抑制率/%空白血清組0.77±0.05 - 1.48±0.04 - 1.92±0.03 -馬紅丸組 0.68±0.02 11.69±2.99 1.18±0.02## 20.27±3.38＊＊ 1.43±0.02## 25.52±1.76＊＊阿霉素組 0.62±0.03 19.48±4.76 1.02±0.06## 31.08±4.65＊＊ 1.19±0.05## 32.28±2.82＊＊

3.2 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞LDH釋放量的影響

30 %空白對照組與正常組細胞培養(yǎng)液上清中LDH量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而30%馬紅丸含藥血清及阿霉素含藥血清組細胞培養(yǎng)液上清中的LDH量明顯升高，與30%空白血清組比較具有顯著差異（P＜0.01）。見圖1。

3.3 馬紅丸含藥血清對smmc-7721細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測可見正常對照組細胞及空白對照組細胞的凋亡率分別為4.7%和5.5%，兩組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。30%馬紅丸含藥血清和阿霉素含藥血清組的凋亡率分別為23.6%和26.8%，與空白血清組比較具有明顯差異（P＜0.01）。見圖2。

3.4 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞bcl-2和bax mRNA表達的影響

30 %空白血清組細胞與正常對照組bcl-2/GAP-DH，bax/GAPDH和bax/bcl-2比值無明顯差異（P＞0.05）；30%馬紅丸含藥血清及阿霉素含藥血清處理smmc-7721細胞后，bcl-2 mRNA表達降低，bax mRNA表達增加，bax/bcl-2比值具有明顯差異 （P＜0.01）。見圖3和表2。

圖1 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞LDH釋放量的影響（±s，n=3）與空白對照組比較，＊＊P＜0.01。Fig.1 Influence of Mahong Pill containing serum on the lactate dehydrogenase（LDH）leakage of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

圖2 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞凋亡的影響（±s，n=3）與空白對照組比較，＊＊P＜0.01。Fig.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the apoptotic rate of human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

4 討論

腫瘤的發(fā)生與細胞增殖分化異常及其凋亡受抑制有關，腫瘤組織內細胞存活與凋亡的平衡失調，存活大于凋亡，則腫瘤細胞數目增加［5］。因此，促進腫瘤細胞凋亡是腫瘤防治的重要手段。凋亡是細胞在基因調控下的主動死亡形式，調控凋亡的基因可分為凋亡促進基因和凋亡抑制基因兩類。Bcl-2是有抑制凋亡作用的基因，Bax的作用與Bcl-2相反。下調Bcl-2或上調Bax可促進多種因素誘導的多種腫瘤細胞凋亡［6-7］。本實驗采用血清藥理學的方法，觀察了馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞增殖的抑制作用和促細胞凋亡以及對bcl-2和bax的影響。結果表明，馬紅丸含藥血清具有良好的抑制人肝癌smmc-7721細胞增殖作用，促進細胞LDH外漏，并在一定濃度范圍內，呈劑量依賴性促進smmc-7721細胞凋亡。同時可見，馬紅丸含藥血清處理后，可誘導smmc-7721細胞凋亡促進基因Bax表達，減少凋亡抑制基因Bcl-2的表達，Bax與Bcl-2比值升高，從而促進腫瘤細胞凋亡。

圖3 馬紅丸含藥血清對bcl-2和bax mRNA表達的影響M.marker 1.正常對照 2.空白對照 3.馬紅丸 4.阿霉素Fig.3 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2 and bax mRNA in human hepatoma smmc-7721cellsM.marker 1.normal control 2.blank serum control 3.Mahong Pill 4.adriamycin

表2 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞bcl-2/GAPDH和bax/GAPDH的影響（±s，n=3）Tab.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2/GAPDH and bax/GADPH in human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）

表2 馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞bcl-2/GAPDH和bax/GAPDH的影響（±s，n=3）Tab.2 Influence of Mahong Pill containing serum on the expression of bcl-2/GAPDH and bax/GADPH in human hepatoma smmc-7721cells（±s，n=3）

與空白對照組比較，＊＊P＜0.01。＊＊P＜0.01 vs blank serum group.

組別 bcl-2/GAPDH bax/GAPDH bax/bcl-2比值正常對照組0.87±0.02 0.59±0.04 0.67±0.03空白對照組 0.85±0.04 0.60±0.01 0.65±0.05馬紅丸組 0.56±0.03＊＊ 0.99±0.03＊＊ 1.88±0.07＊＊阿霉素組 0.47±0.01＊＊ 1.22±0.10＊＊ 2.58±0.06＊＊

綜上所述，馬紅丸含藥血清對人肝癌smmc-7721細胞增殖具有抑制和促凋亡作用，其作用機理與減少凋亡抑制基因Bcl-2表達，上調Bax表達，誘導腫瘤細胞凋亡有關。

［1］Batty G D，Barzi F，Huxley R.Obesity and liver cancer mortality in Asia：The Asia Pacific Cohort Studies Collaboration［J］.Cancer Epidemiol，2009，33：469-472.

［2］湯振邦.并用馬紅丸治療惡性腫瘤的療效觀察［J］.現代中西醫(yī)結合雜志，2000，9（1）：54-55.

［3］嵇玉峰，李金昌，梁洪江，等.馬紅丸對肝癌大鼠血管形成的影響［J］.實用心腦肺血管病雜志，2009，17（4）：281-282.

［4］李儀奎，吳健宇.血清藥理實驗中采血時間的通法方案［J］.中國藥理學通報，1999，15（6）：569-570.

［5］楊全會，許榮焜.細胞凋亡與腫瘤［J］.生理科學進展，2006，37（4）：373-378.

［6］Hengartner M O.The biochemistry of apoptosis ［J］.Nature，2000，407（6805）：770-776.

［7］呂俊華，沈文娟，韋笑梅，等.荔枝核提取物對荷瘤小鼠腫瘤細胞Bax和Bcl-2蛋白表達的影響［J］.中成藥，2008，30（9）：1381-1383.

Effect of Mahong Pill containing serum on the expression of bax and bcl-2 mRNA of human hepatoma smmc-7721 cells

FANG Wen-juan1， YU Lu-yao2， LI Da-peng3， HUANG Jin-huo3， Lü Jun-hua2
（1.Infinitus（China）Co.，Ltd，Guangzhou 510665，China；2.School of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou 510632，China；3.Guangzhou Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou 510130，China）

Mahong Pill；serologic pharmacology；human hepatoma smmc-7721 cells；apoptosis

R285.5

A

1001-1528（2011）07-1141-05

2010-06-02

方文娟（1980—），女，碩士，工程師，從事腫瘤藥理學研究。Tel：（020）81107220，E-mail：wenjuan-fang@infinitus.com.cn

*通信作者：呂俊華（1954—），男，教授。Tel：（020）85223764，E-mail：yaolilv@163.com