齊雙巖， 金若敏， 梅彩霞， 周志蘭， 崔金剛

(上海中醫(yī)藥大學藥物安全評價研究中心上海 201203)

川楝子(Fructus Toosendan)是臨床常用藥，《中國藥典》2010年版所載川楝子為楝科植物川楝Melia toosendanSieb.et Zucc.的干燥成熟果實，性苦味寒，有小毒，本課題前期實驗研究發(fā)現(xiàn)，大鼠或小鼠口服大劑量的川楝子后可致肝損傷［1－2］，其損傷機制與肝細胞的損傷、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應有關(guān)［3－4］，且川楝子批號不同毒性大小亦不同。根據(jù)中醫(yī)藥配伍理論，對川楝子的減毒配伍規(guī)律進行了初步研究，結(jié)果表明白芍對川楝子所致肝毒性的減毒效應較明顯［5］，為進一步明確白芍減毒效應的特點，本試驗將對白芍減輕川楝子毒性的作用機制展開研究，希望能探索出中藥復方配伍減毒的新的研究思路和研究方法，為中醫(yī)藥配伍理論和中藥復方的安全應用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 試驗動物

SD大鼠，♀♂各半，體重160～180 g，清潔級，由上海必凱動物有限公司提供，動物質(zhì)量合格證號SCXK(滬)2003－2002，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 主要試劑

TNF－α(貨號 RY10019)、IL－6(貨號 RY10029)由RnD公司提供;即用型SABC免疫組化染色試劑盒、ICAM－1(CD54)一抗、NF－κB 一抗、DBA 顯色試劑盒均由武漢博士德生物工程有限公司提供;兔抗bcl－2抗體由 Cell Signaling Technology公司提供，兔抗caspase－3抗體由BD Biosciences Pharmingen公司提供，兔抗 β－actin抗體、羊抗兔由 IgG/HRP，Abcam公司提供，ECL發(fā)光試劑盒由SANTA CRUZE公司提供。

2 方法

2.1 藥材制備

川楝子(批號 060825，070615)，白芍(批號061121)，購于上海養(yǎng)和堂張江分店，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學中藥學院趙志禮教授鑒定。

藥材制備方法(水提醇沉):將藥物粉碎至顆粒狀，水煎3次，每次先以武火煮沸，再以文火煮30 min，過濾，合并3次藥液，加“體積分數(shù)為0.95的乙醇”至濃度為70%，4℃冰箱放置過夜，濾去沉淀，回收乙醇，將上述水提醇沉液濃縮至濃度為10 g/mL，HPLC法測定含川楝素6.075×10－4g/g生藥。藥液置4℃冰箱，避光保存?zhèn)溆?。臨用前，用蒸餾水分別配成所需濃度的溶液。川楝子配伍白芍(根據(jù)白芍的臨床常用劑量及預試驗篩選的減毒最佳劑量確定白芍的使用劑量)的提取藥液簡稱“川白”。

2.2 試驗方法

取大鼠隨機分成3組，分別為正常組、川楝子組及川白組，每組10只，♀♂各半。灌胃1次，容積為3 mL/100g。給藥組分別灌服川楝子(150 g生藥/kg)或川白(157.5 g生藥/kg)，正常組給予等容積的蒸餾水。大鼠于給藥或水后2 h處理，處理前禁食不禁水過夜，各組大鼠稱體重，腹腔注射25%烏來糖麻醉，摘取各組大鼠肝臟，取1份肝組織，置于10%中性福爾馬林溶液中固定;令取2份肝組織置于DEPC處理過的離心管，迅速放入液氮中快速冷凍，而后轉(zhuǎn)入超低溫冰箱保存。

2.2.1 雙抗體夾心 ABC－ELISA法檢測肝組織TNF－α、IL－6［6－7］取正常、川楝子及川白組大鼠肝組織各0.2 g，每組6只，分別用冷生理鹽水洗去污血，加冷0.9%生理鹽水2 mL制成10%肝勻漿。3 000 r/min離心10 min，取上清液1.5 mL備用。

采用雙抗體夾心ABC－ELISA法。用抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF－α)或IL－6單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的TNF－α或IL－6與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠TNF－α或IL－6抗體，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入酶底物OPD，出現(xiàn)黃色，加終止液硫酸，顏色變深，在492nm處測OD值，TNF－α或IL－6濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中TNF－α或IL－6濃度。

2.2.2 免疫組化SABC法檢測大鼠肝組織NF－κB、ICAM－1 蛋白表達［8－10］取正常、川楝子及川白組中性福爾馬林固定的大鼠肝組織，每組6只，以APES處理載玻片，按常規(guī)進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，厚度為5 μm。切片60℃恒溫箱中烘烤2 h。常規(guī)脫蠟、脫水。采用免疫組織化學SABC法染色，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

結(jié)果判斷:NF－κB免疫組化染色以細胞質(zhì)和(或)細胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達;ICAM－1免疫組化染色以細胞膜和細胞胞漿內(nèi)呈現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。光鏡下，任選取1個高倍視野(×400)拍片，Image－Pro－Plus 4.0 圖像分析軟件對每張組織片上NF－κB及 ICAM－1蛋白進行定量分析，結(jié)果以累積光密度值(IOD)表示。

2.2.3 Western－Blot法檢測肝組織 caspase－3、bcl－2蛋白表達［11］將少量肝組織置于勻漿器中，加含PMSF的裂解液，在4℃條件下勻漿，裂解30 min后，離心(4℃，12 000 r/min 5min)，取上清液。經(jīng)電泳分離后，在4℃條件下，將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至NC膜上。用10%脫脂奶粉封閉37℃，2 h，PBS洗膜3次;與稀釋于10%脫脂奶粉中的抗體(抗 bcl－2，抗caspase3，抗β－actin)4℃孵育過夜，PBST洗膜3次;與稀釋于10%脫脂奶粉中的羊抗兔IgG/HRP室溫孵育1 h，PBST洗滌3次。等量混合ECL顯色系統(tǒng)的A液+B液，滴加至NC膜表面，X－ray膠片感光。

2.3 統(tǒng)計方法

應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料采用“均數(shù)±標準差(±s)”表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差法，組間兩兩比較方差齊性時用LSD方法分析，方差不齊時用Dunnett’s方法分析。

3 結(jié)果

3.1 對大鼠肝組織TNF－α、IL－6的影響

大鼠給予川楝子以后，肝組織 TNF－α、IL－6水平顯著提高，白芍與川楝子配伍后能夠?qū)垢谓M織TNF－α、IL－6水平的提高，與川楝子組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，白芍顯示了一定的減毒作用。結(jié)果見表1。

表1 白芍配伍川楝子對大鼠肝組織TNF-α、IL-6的影響(±s)

表1 白芍配伍川楝子對大鼠肝組織TNF-α、IL-6的影響(±s)

注:與川楝子組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別 劑量/(g/kg) 動物數(shù)/只TNF－α/(ρg/mL)IL－6/(ρg/mL)正常 — 6 35.5±7.8 51.9±5.8*川楝子 150 6 43.2±10.8 59.8±5.0川白 157.5 6 32.9±4.5* 47.3±5.3**

3.2 對大鼠肝組織NF－κB、ICAM－1蛋白表達的影響

大鼠給予川楝子以后，NF－κB、ICAM－1 蛋白表達顯著增強，與正常組比較有極顯著性差異(P＜0.01);白芍與川楝子配伍后能夠?qū)垢谓M織NF－κB、ICAM－1蛋白表達的增強，與川楝子組比較有極顯著性差異(P＜0.01)，表明白芍有一定的減毒作用。結(jié)果見表2。

表2 白芍配伍川楝子對大鼠肝組織NF-κB、ICAM-1蛋白表達的影響(ˉx ±s)

3.3 對肝組織 caspase－3、bcl－2 蛋白表達的影響

大鼠給予川楝子以后，與正常組比較，caspase－3蛋白表達明顯增加，bcl－2蛋白表達明顯下降;白芍與川楝子配伍后能夠?qū)垢谓M織caspase－3蛋白表達的上調(diào)和bcl－2蛋白表達的下調(diào)，表明白芍有一定的減毒作用。

4 討論

肝主疏泄，性喜條達而惡抑郁，多用疏散肝氣的藥物，但此類藥物多升散，用之不當則耗散肝之陰血，故養(yǎng)肝柔肝為治肝之必需。白芍既能養(yǎng)肝陰，也能補肝血，更是柔肝之要品，切中肝陰易虛的病理特點，也與肝喜柔和的生理特點最為合拍。柔肝養(yǎng)肝即順應了“肝喜柔和”的生理特性，也防止或糾正了肝陰不足的病理變化。本實驗的川楝子與白芍，取其功用相近之相須相使的配伍關(guān)系，來驗證中醫(yī)學通過配伍以制毒糾偏的可行性與科學性，探索白芍減輕川楝子所致肝毒性的可能機制，為探索中藥配伍減毒系統(tǒng)提供實驗研究思路和方法。

本課題前期研究結(jié)果表明，大劑量川楝子可導致肝細胞損傷，肝細胞急性壞死是川楝子肝損害的主要形式［1－4］。在川楝子導致細胞壞死的通路中，抗氧化活性物質(zhì)(SOD、GSH－Px)含量的降低、過氧化產(chǎn)物(MDA)及炎癥因子(NF－κB、ICAM－1、TNF－α)含量的增多從中起到了重要的作用，進而推測氧化應激和炎癥反應是川楝子致肝細胞損傷的重要機制;白芍與川楝子配伍應用后，能夠?qū)勾ㄩ訉е碌难装Y因子表達的增強，并從基因水平上抑制了肝細胞壞死的發(fā)生，表明白芍的減毒機制與對抗川楝子導致的炎癥反應及調(diào)節(jié)抗－促凋亡基因的表達有關(guān)。

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［2］齊雙巖，熊彥紅，金若敏，等.川楝子對小鼠肝毒性的時效和量效關(guān)系研究［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2008，19(11):2694－2696.

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［4］齊雙巖，谷穎敏，金若敏，等.川楝子對大鼠肝組織超微結(jié)構(gòu)和原代培養(yǎng)肝細胞的影響［J］.中國中藥雜志，2009，34(22):2966－2968.

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