呂品田， 周 坤， 王亞珍， 劉 斌

(1.河北省人民醫(yī)院腫瘤科，河北石家莊 050051;2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院心內(nèi)科，河北石家莊 050000)

肺腺癌是臨床常見的惡性度較高的腫瘤之一，發(fā)現(xiàn)時(shí)已多處于進(jìn)展期，很難依靠手術(shù)達(dá)到根治目的。化療作為肺腺癌綜合治療的重要手段，在肺腺癌治療中發(fā)揮重要作用，但腫瘤多藥耐藥性(Multidrug resistance，MDR)的存在導(dǎo)致化療效果并不理想。故尋找新型藥物并逆轉(zhuǎn)腫瘤的MDR表型對提高化療效果、改善預(yù)后意義重大［1］。薏苡仁注射液(康萊特)以中藥薏苡仁提取物為主要成分，近期用于臨床肺腺癌治療已取得明顯效果，且該藥與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用具有抑制腫瘤的協(xié)同作用［2－3］，但關(guān)于該藥具體調(diào)節(jié)肺腺癌MDR表型的機(jī)制報(bào)道很少。因此，本研究應(yīng)用康萊特及肺腺癌常用化療藥物順鉑(CDDP)作用于人肺腺癌細(xì)胞A549，對其對腫瘤細(xì)胞的抑制情況及調(diào)節(jié)腫瘤MDR的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所，細(xì)胞置于含10%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。正常細(xì)胞系人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC(Human brain microvascular endothelial cells)由本院科研中心保存。康萊特由浙江康萊特藥物有限公司提供;注射用順鉑粉針(CDDP，齊魯制藥有限公司)，調(diào)整藥物濃度為0.5μg/mL。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞經(jīng)消化分散后計(jì)數(shù)，制成細(xì)胞懸液，各200μL/孔接種于96孔板內(nèi)，分為康萊特組、CDDP組、康萊特+CDDP組及A549對照組，預(yù)培養(yǎng)24 h后，實(shí)驗(yàn)各組分別加入康萊特及CDDP各20μL。每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔;并設(shè)空白對照(RPMI 1640培養(yǎng)液)和正常對照孔(生理鹽水)，置于37°C，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2 SRB顯色法體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入預(yù)冷的50%的三氯醋酸(TCA)50μL，4℃放置1h以固定細(xì)胞，倒掉固定液，用超純水洗5遍，干燥后每孔加入100 μL SRB液，室溫避光放置10 min。棄去SRB，未與蛋白結(jié)合的SRB用1%醋酸液洗5遍，空氣干燥，結(jié)合的SRB用150 μL 10 mmol/L非緩沖Tris堿液(pH10.5)溶解，545 nm處測定每孔OD值。腫瘤細(xì)胞平均抑制率(IR)=(1－給藥孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)(RT－PCR)法檢測各MDR因子mRNA的表達(dá)

Trizol Reagent購自華美生物工程公司(Invitrogen公司產(chǎn)品)，一步法提取組織總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠(含EB)電泳鑒定RNA完整性，紫外分光光度法測定RNA的純度及含量。取2 μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，20 μL 反應(yīng)體系包括 Oligo(dT)0.1 μg，2 mmol/L dNTPs2.5 μL，Rnasin 0.1 μg 和 MMLV 200 U，反應(yīng)條件42℃1 h，95℃5 min。每樣本分別取1μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物建立40 μL PCR反應(yīng)體系。以GAPDH作為內(nèi)參照基因。PCR反應(yīng)參數(shù)如下:96℃預(yù)變性4 min;然后94℃ 變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸反應(yīng)5 min。各因子引物序列如下:MDR1(438bp):引物(F)5’－CGCCAATGATGCTGCTCAAG－3’，(R)5 ’－ ACCAAGTAGGCTCCAAACCG－3 ’;Bcl－2(373bp):引物 (F)5’－AGAGGGGCTACGAGTGGGAT－3’，(R)5’－TCAAAGAAGGCCACAATCCTCC－3’;Bax(353bp):引 物 (F)5 ’－TTGCTTCAGGGTTTCATCCAG－3’，(R)5’－AAGTCCAATGTCCAGCCCAT－3’。RT－PCR 產(chǎn)物經(jīng) 2% 瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，通過凝膠掃描儀進(jìn)行DNA電泳條帶分析，各產(chǎn)物與GAPDH的比值作為表達(dá)水平的參數(shù)，進(jìn)行PCR產(chǎn)物相對定量。

1.4 Western blot法檢測增殖、凋亡因子蛋白的表達(dá)

P－gp、Bcl－2、Bax 一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品。收取每組107個(gè)對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞，分別加入細(xì)胞裂解液100 μL，冰浴 20 min，使細(xì)胞充分裂解。4℃，8 000 r/min離心10 min，收集上清，Bradford法測定蛋白濃度。每組取40μg蛋白樣品，10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉90 min，分別加入400倍稀釋的一抗，4℃過夜。加入二抗，漂洗后暗室曝光，常規(guī)顯影、定影。用BioRad圖像分析系統(tǒng)分析，以蛋白條帶的平均吸光度值(A值)表示蛋白表達(dá)的相對強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析。組間強(qiáng)度比值使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 康萊特聯(lián)合CDDP對A549細(xì)胞的體外抑制作用

各組細(xì)胞中，與對照組比較，康萊特組、CDDP組、康萊特 +CDDP組 OD值明顯降低(均P＜0.05)，以康萊特+CDDP組OD值降低最為明顯(P＜0.01);康萊特對正常細(xì)胞系HBMEC則無明顯抑制作用(P＞0.05)。見表1、圖1。

表1 康萊特、順鉑對A549細(xì)胞和正常細(xì)胞的體外抑制作用

圖1 各組細(xì)胞MDR1、Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平

2.2 各組細(xì)胞 MDR1、Bcl－2、Bax mRNA 表達(dá)強(qiáng)度的比較

RT－PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，康萊特組、CDDP 組、康萊特 +CDDP 組 P－gp和 Bcl－2 mRNA 強(qiáng)度均較空白對照組降低(均P＜0.05)，而Bax mRNA強(qiáng)度則明顯升高(P＜0.05);以康萊特+CDDP組變化最為顯著(均P＜0.01)。而康萊特對正常細(xì)胞系HBMEC的4種因子mRNA則無明顯影響(均P＞0.05)。見圖1。

2.3 組細(xì)胞 P－gp、Bcl－2、Bax Western Blot檢測結(jié)果的比較

Western Blot檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，康萊特組、CDDP組、康萊特 +CDDP組 P－gp和 Bcl－2蛋白水平均較對照組降低(均P＜0.05)，而Bax蛋白水平則明顯升高(P＜0.05);以康萊特+CDDP組變化最為顯著。而康萊特對正常細(xì)胞系HBMEC的3種MDR因子蛋白水平則無明顯影響(均P＞0.05)。見圖2。

圖2 Western blot法檢測各組細(xì)胞MDR1、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平

3 討論

康萊特主要成分為薏苡仁提取物，具有益氣養(yǎng)陰，消癖散結(jié)等功能，適用于氣陰兩虛，脾虛濕困型原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌，該藥單獨(dú)應(yīng)用或與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用已在非小細(xì)胞肺癌包括肺腺癌的治療方面取得了良好效果［2－3］。康萊特可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用［4－5］，但其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)是否有化療增敏效果及其與肺腺癌MDR關(guān)系的研究報(bào)道很少。本研究顯示，康萊特對肺腺癌細(xì)胞A549有明顯的抑制作用;該藥作用于A549后腫瘤細(xì)胞的耐藥相關(guān)因子MDR1/P－gp和凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)Bcl－2水平明顯降低，而促凋亡蛋白Bax則水平升高，說明康萊特可通過調(diào)節(jié)上述因子水平逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR，達(dá)到抑制腫瘤的作用，但由于腫瘤MDR調(diào)控是多途徑、網(wǎng)絡(luò)式調(diào)節(jié)，康萊特具體參與了哪些途徑還有待進(jìn)一步深入研究。本結(jié)果還顯示康萊特對于人正常細(xì)胞(人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞HBMEC)無明顯抑制作用，對該細(xì)胞的MDR因子水平也無顯著影響，說明康萊特在用于肺腺癌治療中有較強(qiáng)的選擇性，對正常組織毒副作用較低，是較為理想的肺腺癌治療用藥。

肺腺癌由于起病隱匿，不易早期發(fā)現(xiàn)，患者就診時(shí)多已處于進(jìn)展期或晚期，手術(shù)難以達(dá)到徹底根治或已失去手術(shù)機(jī)會。故目前包括化療在內(nèi)的各種措施在該病的治療中發(fā)揮著主要作用，而肺腺癌腫瘤細(xì)胞具有的MDR特性常導(dǎo)致化療失敗［6］，結(jié)合中藥治療以提高化療效果、減輕毒副反應(yīng)已成為當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)［7］。目前已有報(bào)道康萊特與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對腫瘤細(xì)胞殺傷有協(xié)同作用［3，8］，但具體機(jī)制尚無明確報(bào)道。故本研究對康萊特聯(lián)合化療藥物CDDP對A549細(xì)胞系的作用情況進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，康萊特聯(lián)合CDDP對A549的殺傷率較單獨(dú)應(yīng)用放療更強(qiáng)，該作用是通過抑制DR1/P－gp的藥泵作用和凋亡抑制蛋白Bcl－2的抗凋亡作用，同時(shí)促進(jìn)Bax的促凋亡作用而實(shí)現(xiàn)的。這說明康萊特具有MDR逆轉(zhuǎn)作用，與化療藥物聯(lián)合使用可提高腫瘤細(xì)胞的化療敏感性。

本研究初步證實(shí)康萊特可通過逆轉(zhuǎn)肺腺癌細(xì)胞的MDR來增強(qiáng)化療效果，與化療具有協(xié)同作用。但本研究僅檢測了部分MDR相關(guān)因子在用藥前后水平的變化，對其中轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等具體機(jī)制尚未進(jìn)行深入研究;體外細(xì)胞系研究也與臨床研究存在較大差距。有待更深入研究其作用機(jī)制并應(yīng)用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)予以驗(yàn)證，以期確定合適的康萊特與化療聯(lián)合作用方式，改善肺腺癌治療的效果。

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