鄭 剛，駱文靜，陳耀明，劉明朝，馬金龍，陳景元

(第四軍醫(yī)大學軍事預(yù)防醫(yī)學系勞動與環(huán)境衛(wèi)生學教研室，陜西 西安 710032)

應(yīng)激對大腦功能的影響是神經(jīng)科學和心理學領(lǐng)域研究的熱點問題。較多的研究證實，當人或動物處于強烈的急性應(yīng)激或長期慢性應(yīng)激的狀態(tài)時，其大腦功能(如學習記憶等)可受到明顯的損害[1，2]。目前的研究大多采用單一的應(yīng)激原進行刺激，如束縛、足電擊等。但在實際情況下，應(yīng)激原通常是復合存在的。有關(guān)復合應(yīng)激原影響大腦學習記憶功能的分子機制的研究目前還較少。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，大腦皮質(zhì)、海馬是與學習記憶功能密切相關(guān)的重要腦區(qū)。本實驗建立慢性復合應(yīng)激大鼠模型，觀察應(yīng)激對大鼠學習記憶功能的影響，以及應(yīng)激反應(yīng)過程中海馬、前額皮質(zhì)組織中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)表達的變化，探討慢性復合應(yīng)激對學習記憶功能的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

成年雄性SD大鼠90只，體重 200～250g，由第四軍醫(yī)大學實驗動物中心提供。首先將大鼠在動物飼養(yǎng)室中適應(yīng)1周，室溫(23±1)℃，相對濕度50%，自然光照，通風良好，自由進食飲水。將大鼠隨機分為對照組(n=18)和應(yīng)激組(n=72)。

1.2 應(yīng)激方法

慢性復合應(yīng)激方法:分別采用低溫暴露(-15℃，3 h/d)、噪聲(20Hz-20kHz，30min/d)、足電擊(45 V ，1 s/pulse，間隔 5 s，30min/d)、束縛(2 h/d)、尾部懸吊(3h/d)、睡眠剝奪(24h/d)、振蕩(水平振蕩頻率120b/min，10min/d)等7種方式，按照上述順序每天采用一種方法對大鼠進行應(yīng)激刺激。應(yīng)激組大鼠平均分為4組 ，每組 18只，分別接受 1、2、3、4 周的應(yīng)激刺激。

1.3 學習記憶功能觀察

Morris水迷宮直徑120cm，深40cm，水深25 cm，平臺高23 cm，平臺直徑10cm;水溫23℃±2℃，在水中加入適量奶粉使之不透明。將平臺置于迷宮某一象限對角線中點處并在整個訓練過程中保持不變，連續(xù)3 d進行定位航行實驗訓練。每只大鼠每天連續(xù)接受8次訓練，方法為將大鼠依次從4個象限，面向池壁放入水中，每次訓練搜索時間為60s。大鼠每次找到平臺后，使之在平臺上停留20s;若超過60s未能找到平臺者，由實驗者引導其爬上平臺并停留20s。上述訓練的目的是使大鼠基本掌握水迷宮訓練模式及搜索平臺的技巧。水迷宮訓練結(jié)束24h后應(yīng)激組大鼠開始接受各種應(yīng)激刺激，第1、2、3、4周最后1天刺激結(jié)束后24h重復進行8次定向航行實驗。在此期間對照組大鼠不接受任何處理，與應(yīng)激組大鼠同步進行定向航行實驗。所有大鼠每次訓練找到平臺的潛伏期由攝像裝置拍攝并傳輸?shù)接嬎銠C保存、分析。

1.4 激素水平檢測

分別于1、2、3、4 周應(yīng)激結(jié)束后，斷頭處死未進行水迷宮訓練的應(yīng)激組和對照組大鼠各8只，取血，室溫下放置4h，3000r/min離心 15 min，取上清液(血清)，按照放射免疫分析試劑盒的說明書檢測皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)的水平。

1.5 免疫印跡法(Western blot)檢測ERK1/2的磷酸化水平

1.5.1 組織樣品處理 斷頭處死大鼠后，每組隨機選取3只取全腦，按照大鼠神經(jīng)解剖圖譜分離海馬、前額皮質(zhì)等腦區(qū)組織。分別稱取上述腦區(qū)組織各50mg于玻璃勻漿器中，加入500μl組織細胞裂解液(含50mmol/L Tris-HCl，pH 7.4;300mmol/L NaCl;10ml/L乙基苯基聚己二醇(Nonidet P-40);1 g/L SDS，1 mmol/L EDTA;1mmol/L Na3VO4，100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF);蛋白酶抑制劑(cocktail))，勻漿，冰水浴約 20min，4℃、12000r/min離心 15 min，取少量上清液，采用考馬斯亮藍法定量分析樣品中的總蛋白含量。其余上清液加入等量 2×SDS Sample Buffer，煮沸 5 min，保存于-80℃。

1.5.2 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western blot檢測ERK1/2的磷酸化水平 配制5%的積層膠和12%的分離膠;根據(jù)蛋白定量分析結(jié)果，調(diào)整各泳道樣品中蛋白總量一致。電泳80V/20min，120V/80min結(jié)束，250mA/90min將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜;以封閉液(25mmol/L TBS溶液，50g/L脫脂奶粉，1 ml/L吐溫-20)室溫封閉 1 h。加一抗，于 4℃過夜;洗膜;加相應(yīng)二抗，37℃孵育 1.5 h;洗膜。滴加化學熒光試劑(美國Pierce公司)，在暗室中用X光膠片(Kodak)壓片成像。凝膠成像分析儀(美國SYNGENE公司)掃描各免疫印跡條帶灰度值并進行分析。所使用抗體及稀釋濃度:p-ERK(鼠單抗，1:1000稀釋)，ERK1(兔多抗，1:3000稀釋)，二抗(羊抗鼠，1:2000稀釋;羊抗兔，1:6000稀釋);以上抗體均購于美國Santa Cruz公司。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 慢性復合應(yīng)激對大鼠學習記憶能力的影響

大鼠Morris水迷宮定位航行在接受慢性復合應(yīng)激以后第1周和第2周，找到隱藏平臺的潛伏期顯著延長(P＜0.05);第3周時雖然應(yīng)激組大鼠潛伏期絕對值略有延長，但兩者無顯著性差異(P＞0.05);而第4周時應(yīng)激組大鼠潛伏期比對照組顯著延長(P＜0.05，圖1)。上述結(jié)果提示慢性復合應(yīng)激損害大鼠的學習記憶功能，但是在第3周時有一短時間的恢復。

Fig.1 Effects of chronic stress on learning andmemory of rats in the Morris water maze test(，n=10)

2.2 慢性復合應(yīng)激對大鼠血清糖皮質(zhì)激素水平的影響

慢性應(yīng)激后，大鼠血清中CORT水平升高，1周和2周時均顯著高于對照組水平;3周時CORT水平有一定回落，與對照組水平無顯著性差異(P＞0.05);而4周時則再次升高，且顯著高于對照組水平(圖2)。

Fig.2 Effects of chronic stress on the serum CORT level of the rats(，n=8)

2.3 慢性復合應(yīng)激后不同腦區(qū)ERK1/2表達活化水平的改變

慢性復合應(yīng)激后，大鼠海馬P-ERK1/2水平在1周和2周時顯著降低(P＜0.05)，3周時水平有所恢復，與對照組水平無顯著性差異，而4周時P-ERK1/2水平又再次低于對照組水平。前額皮質(zhì)P-ERK1/2水平在慢性復合應(yīng)激后的變化與海馬基本一致，也呈降低-增高-降低的趨勢。而各時間點總ERK1/2水平無顯著變化(圖3)。

3 討論

應(yīng)激可以對學習記憶功能產(chǎn)生復雜的影響。近年來大量研究表明，應(yīng)激反應(yīng)可以對大腦功能(如學習記憶等)產(chǎn)生損害[2]，然而也有研究發(fā)現(xiàn)在某些情況下適度的應(yīng)激刺激可以有助于提高動物的學習記憶能力[3]。為了探討較長時間的應(yīng)激刺激對學習記憶功能的影響及其機制，在本實驗中我們通過Morris水迷宮實驗觀察慢性復合性應(yīng)激后不同時間點大鼠學習記憶能力的改變。結(jié)果顯示:慢性復合應(yīng)激后大鼠的學習記憶能力顯著下降;而3周時大鼠的學習記憶功能有所恢復。一般認為:應(yīng)激反應(yīng)可以分為3期，即(1)警覺期，是機體對應(yīng)激的初步反應(yīng)，表現(xiàn)為心率加快、血壓升高、骨骼肌的血流量增加等，動用機體的防衛(wèi)機制以克服應(yīng)激。(2)抵抗期，此期是機體內(nèi)部防御力量處于高水平的狀態(tài)，機體與應(yīng)激原對峙的結(jié)果有兩種:一是機體戰(zhàn)勝了應(yīng)激原，內(nèi)環(huán)境重建穩(wěn)定;二是應(yīng)激原持續(xù)存在，機體受到損害而進入衰竭期。(3)衰竭期，出現(xiàn)病理性應(yīng)激表現(xiàn)，內(nèi)環(huán)境紊亂和全身適應(yīng)綜合征。本實驗結(jié)果提示，慢性復合性應(yīng)激可以損害大鼠的學習記憶能力，3周時學習記憶功能的恢復可能是在較長時間的應(yīng)激反應(yīng)中，大鼠自身的防御力量逐漸與應(yīng)激刺激達到一種平衡關(guān)系;但是應(yīng)激時間達到4周時，大鼠的學習記憶能力再次嚴重下降，這種現(xiàn)象可能是由于大鼠對應(yīng)激做出的自身調(diào)整在3周時達到了一種與應(yīng)激負荷之間的暫時性平衡，而應(yīng)激刺激繼續(xù)作用將可能打破這種平衡關(guān)系，從而損害大腦功能。

Fig.3 Effects of chronic stress on P-ERK levels in the hippocampus and prefrontal cortex of the rats(，n=4)

應(yīng)激的主要非特異性反應(yīng)之一是下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPA)軸的激活，從而引起全身性代謝效應(yīng)、生理變化乃至行為改變和疾病發(fā)生。在應(yīng)激狀態(tài)下，CORT的濃度往往呈上升趨勢[4]，一方面可以幫助機體緩沖和適應(yīng)應(yīng)激刺激，但另一方面也是導致機體發(fā)生應(yīng)激疾病的重要因素。本實驗結(jié)果表明，慢性應(yīng)激后，大鼠血清中CORT水平顯著增高，但在3周時出現(xiàn)恢復，與對照組水平無顯著差異。上述結(jié)果提示，慢性應(yīng)激可以顯著影響機體的內(nèi)分泌系統(tǒng)，長時間高水平激素的作用可能與應(yīng)激誘導的學習記憶損傷密切相關(guān);3周時CORT水平的短時間下降可能與機體對應(yīng)激刺激的適應(yīng)性有關(guān)，而隨著應(yīng)激時間的延長，機體則可能不再繼續(xù)適應(yīng)而造成損傷。

海馬、前額皮質(zhì)是與大腦學習記憶功能密切相關(guān)的腦區(qū)[5，6]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)信號分子在上述腦區(qū)表達豐富，并對神經(jīng)細胞信號轉(zhuǎn)導起著重要的介導作用，從而調(diào)控大腦功能。其中研究最多的是ERK1/2(分別為p44和p42 MAPK)，其主要功能與細胞的增殖與分化相關(guān)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，ERK是記憶形成的相關(guān)分子，海馬ERK1/2的磷酸化對于學習記憶過程是必不可少的[7]，使用 ERK通路阻斷劑PD98059能夠抑制海馬長時程增強(long-term potentiation，LTP)的誘導[8]。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，慢性復合應(yīng)激可以引起大鼠大腦海馬、前額皮質(zhì)P-ERK水平的下降，3周時P-ERK水平有所回升，可能與機體的適應(yīng)有關(guān)，但4周時上述腦區(qū)P-ERK的水平再次下降。上述結(jié)果表明，慢性復合性應(yīng)激對大腦海馬、前額皮質(zhì)ERK信號分子磷酸化的作用主要是下調(diào)，而在3周時的短暫回升可能是由于機體對應(yīng)激刺激的適應(yīng)性變化引起的，而當應(yīng)激刺激持續(xù)作用，機體不能繼續(xù)適應(yīng)時，P-ERK水平再次下降。Meller等[9]發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可以引起大鼠大腦ERK1/2磷酸化水平的降低，這與我們的實驗結(jié)果基本一致，但該實驗并未檢測慢性應(yīng)激影響MAPKs信號分子表達活化的時間效應(yīng)。在本實驗中，應(yīng)激后大鼠ERK1/2磷酸化水平具有與學習記憶能力相似的變化趨勢，提示慢性復合應(yīng)激可能通過降低海馬、前額皮質(zhì)ERK1/2的磷酸化水平而介導了大鼠學習記憶能力的損害。

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