余邦良，楊柳，王秀玲（1.海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，?？谑?571101；.海南紫杉園藥業(yè)有限公司，?？谑?57016）

甲狀旁腺激素1-34用于絕經(jīng)后女性骨質(zhì)疏松癥，能增加患者骨密度并降低脊椎與非脊椎骨折的風(fēng)險(xiǎn)[1，2]，而且其作用強(qiáng)于阿侖膦酸鈉[3，4]；同時(shí)，其也可以用于提高男性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥或性腺功能減退的骨質(zhì)疏松癥患者的骨量。該藥治療范圍包括原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥、繼發(fā)性骨質(zhì)疏松癥和具有骨質(zhì)疏松引發(fā)骨折病史的患者，或有多種誘發(fā)骨折的風(fēng)險(xiǎn)及以往的骨質(zhì)疏松癥針對(duì)性治療方法對(duì)其失敗或無(wú)法耐受的患者[5，6]。甲狀旁腺激素1-34注射劑作為一種全新的抗骨質(zhì)疏松藥物，由美國(guó)Lilly公司研發(fā)成功，并于2002年12月在美國(guó)上市，商品名Forteo[7]。但該品種目前在我國(guó)沒(méi)有上市。由于甲狀旁腺激素1-34是采用固相合成的多肽物質(zhì)，精制純化后可能會(huì)存在相關(guān)肽類雜質(zhì)，而這些雜質(zhì)的存在會(huì)影響藥品的質(zhì)量，所以需要在原料藥標(biāo)準(zhǔn)中建立其有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)項(xiàng)。本文采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定甲狀旁腺激素1-34原料藥中有關(guān)物質(zhì)的含量，并進(jìn)行了方法學(xué)研究。

1 儀器與試藥

Waters 2695型HPLC儀、Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器、Waters Millennium32色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；BP211D電子天平（德國(guó)Sartorius公司）。

甲狀旁腺激素1-34對(duì)照品（美國(guó)Peptide公司，批號(hào):M10029B1，含量:99.7%）；甲狀旁腺激素1-34原料藥（地奧集團(tuán)成都藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):100201、100202、100203，含量分別為99.4%、99.3%、98.9%）；乙腈為色譜純，氯化鉀為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:Kromasil C18（250mm ×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相:0.05 mol·L－1氯化鉀水溶液（pH4.5，磷酸調(diào)節(jié)）-乙腈＝75∶25；流速:1.0mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm；柱溫:室溫；進(jìn)樣量:20μL。

2.2 溶液的制備

供試品溶液:取甲狀旁腺激素1-34原料藥適量加水溶解并稀釋制成每1mL中含甲狀旁腺激素1-341.0mg的溶液，作為供試品溶液。

對(duì)照品溶液:取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的甲狀旁腺激素1-34對(duì)照品適量加水溶解，制備成每1mL中約含甲狀旁腺激素1-341.0mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

自身對(duì)照溶液:精密量取上述供試品溶液1mL，置于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液20μL，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以甲狀旁腺激素1-34計(jì)在2000以上。甲狀旁腺激素1-34與相鄰雜質(zhì)峰的分離度≥1.5。

2.4 專屬性試驗(yàn)

2.4.1 酸破壞樣品溶液:精密稱取甲狀旁腺激素1-34原料藥適量，加6 mol·L－1的鹽酸溶液2mL，使其溶解后，放置在水浴中加熱30min，放冷，用1 mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)至中性后，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

2.4.2 堿破壞樣品溶液:精密稱取甲狀旁腺激素1-34原料藥適量，加1 mol·L－1的氫氧化鈉溶液2mL，使其溶解后，放置在水浴中加熱1 h，放冷，用1 mol·L－1鹽酸溶液調(diào)至中性后，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

2.4.3 氧化破壞樣品溶液:精密稱取甲狀旁腺激素1-34原料藥適量，加3%的過(guò)氧化氫溶液2mL，溶解后，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

2.4.4 光破壞樣品溶液:取甲狀旁腺激素1-34原料藥，置于4000 lx的燈光下照射48 h，精密稱取適量，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

2.4.5 高溫破壞樣品溶液:取甲狀旁腺激素1-34原料藥，置于130℃環(huán)境中放置2 h，冷卻，精密稱取適量，用水稀釋成每1mL中約含1.0mg的甲狀旁腺激素1-34溶液。

精密量取上述各種破壞溶液20μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果，經(jīng)酸、堿、氧化、光和高溫破壞后的供試品溶液的色譜中均有不同程度的雜質(zhì)峰產(chǎn)生，且均與主成分峰分離良好，因此該色譜條件滿足有關(guān)物質(zhì)檢查的系統(tǒng)適用性要求。色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對(duì)照品；B.供試品；C.酸破壞樣品；D.堿破壞樣品；E.氧化破壞樣品；F.光破壞樣品；G.高溫破壞樣品；1.甲狀旁腺激素1-34；2、3、4.雜質(zhì)Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.sample；C.sample destroyed by acid；D.sample destroyed by base；E.sample destroyed by oxidation；F.sample destroyed by light；G.sample destroyed by high temperature；1.PTH 1-34；2，3，4.impurities

2.5 峰純度檢查

分別取“2.4”項(xiàng)下的5種破壞溶液各20μL進(jìn)樣測(cè)定，經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，其主成分峰的純度為999.996（閾值為950），表明主成分峰未包含其他雜質(zhì)峰。

2.6 最小檢出量的確定

取甲狀旁腺激素1-34對(duì)照品適量，用水溶解并稀釋至每1mL中含25 ng的溶液，精密量取該溶液20μL注入液相色譜儀測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果S/N＝3，最小檢出量為0.5 ng。

2.7 線性關(guān)系考察

由于甲狀旁腺激素1-34有關(guān)物質(zhì)的對(duì)照品不易獲得，在假設(shè)主成分與各雜質(zhì)的影響因子均相同的前提下，考察雜質(zhì)量在自身對(duì)照溶液濃度附近變化時(shí)的線性規(guī)律[8]。吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5mL分別置于100mL容量瓶中用水稀釋定容。精密吸取上述不同濃度的溶液各20μL注入液相色譜儀，記錄色譜，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程:Y＝1.517×104X－5.158×102（r＝0.99996）。結(jié)果表明，甲狀旁腺激素1-34有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)濃度線性范圍為5～50μg·mL－1，即雜質(zhì)量在該濃度范圍內(nèi)變化時(shí)，用自身對(duì)照溶液進(jìn)行定量，能夠得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果[9]。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液于室溫下放置，分別于0、2、4、6、12 h進(jìn)樣20μL分析。結(jié)果，供試品溶液的主成分峰及雜質(zhì)峰的峰面積均基本一致，RSD＝0.49%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 樣品中有關(guān)物質(zhì)的含量測(cè)定

取3批樣品，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品和自身對(duì)照溶液；精密量取自身對(duì)照溶液20μL，注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主峰高為滿量程的20%；再精密量取供試品溶液和自身對(duì)照溶液各20μL進(jìn)樣，記錄色譜至主成分峰保留時(shí)間的4倍。按主成分自身對(duì)照法以峰面積計(jì)算雜質(zhì)的量。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，各雜質(zhì)峰的面積之和不得大于自身對(duì)照溶液主峰面積。結(jié)果，3批樣品中有關(guān)物質(zhì)含量均小于0.29%，詳見(jiàn)表1。

表1 3批樣品中有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果Tab 1 Results of content determination of the related substances in 3 batches of samples

3 討論

3.1 波長(zhǎng)的選擇

對(duì)甲狀旁腺激素1-34對(duì)照品溶液于二極管陣列檢測(cè)器上200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示甲狀旁腺激素1-34在210、280 nm波長(zhǎng)處均有吸收峰。因此，將檢測(cè)波長(zhǎng)分別設(shè)為210、280 nm時(shí)進(jìn)行色譜比較，結(jié)果顯示在這2個(gè)波長(zhǎng)下雜質(zhì)的種類和含量沒(méi)有明顯變化。但根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，多肽類樣品的檢測(cè)波長(zhǎng)多采用210或214 nm，故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為210 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

3.2.1 流動(dòng)相組成的影響:廖海明等[11]采用流動(dòng)相A（水-乙腈-三氟乙酸＝990∶10∶1）、流動(dòng)相B（水-乙腈-三氟乙酸＝10∶990∶1），梯度洗脫，在215 nm波長(zhǎng)處測(cè)定甲狀旁腺激素1-34的含量；梁成罡等[12]采用流動(dòng)相A（0.1%三氟乙酸水溶液）、流動(dòng)相B（含0.1%三氟乙酸的乙腈-水＝95∶5），梯度洗脫，在214 nm波長(zhǎng)處測(cè)定甲狀旁腺激素1-34的含量。但這2種方法所使用的流動(dòng)相pH值實(shí)際上小于2，超過(guò)一般反相色譜柱的pH使用范圍（2～8）[13，14]，易導(dǎo)致硅膠相連的化學(xué)鍵合相水解脫落[14]，因而對(duì)色譜柱損害較大；同時(shí)這2種方法采用梯度洗脫，對(duì)色譜柱要求較高；所需洗脫時(shí)間相對(duì)長(zhǎng)，前者主峰出峰時(shí)間為15min左右，根據(jù)要求測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的全程洗脫時(shí)間達(dá)60min，而后者主峰出峰時(shí)間為25min左右，根據(jù)要求測(cè)定有關(guān)物質(zhì)的全程洗脫時(shí)間達(dá)100min。為此，筆者在水相中加入氯化鉀，并用磷酸調(diào)節(jié)pH值，等度洗脫，大大縮短了分析時(shí)間，而且能滿足系統(tǒng)適用性要求，因此用此流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)。

3.2.2 流動(dòng)相pH的影響:甲狀旁腺激素1-34對(duì)酸較穩(wěn)定，對(duì)堿不穩(wěn)定[12]，筆者將流動(dòng)相中0.05 mol·L－1氯化鉀水溶液的pH值用磷酸分別調(diào)至2.0、4.5、6.0，考察其色譜行為，結(jié)果pH值在4.5時(shí)拖尾因子最小，分離效果最好。

3.2.3 流動(dòng)相中有機(jī)溶劑濃度的影響:乙腈量為10%時(shí)，主峰保留時(shí)間較長(zhǎng)，這樣不僅浪費(fèi)時(shí)間，而且也浪費(fèi)昂貴的有機(jī)流動(dòng)相；而乙腈量增加到40%時(shí)，主峰保留時(shí)間太短，主峰理論板數(shù)達(dá)不到要求，且與雜質(zhì)的分離不符合要求；當(dāng)乙腈量為25%時(shí)，保留時(shí)間適中，主峰理論板數(shù)符合要求，與雜質(zhì)的分離也符合要求。故確定水相與乙腈相比例為75∶25。

綜上所述，所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可用于甲狀旁腺激素1-34原料藥中有關(guān)物質(zhì)的含量測(cè)定。

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