畢研麗 ，郭廣君 ，，呂素芳 ，魏 鳳 ，，沈志強(qiáng) ，

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600；2.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600）

偽狂犬病病毒（PRV）是引起多種家畜和野生動(dòng)物以發(fā)熱、流產(chǎn)和死亡、奇癢及腦脊髓炎為主要癥狀的一種皰疹病毒，對養(yǎng)豬業(yè)已造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失?；蚪M為線狀雙股DNA，核酸長度約150 kb，病毒基因組是由長獨(dú)特區(qū)（UL）、短獨(dú)特區(qū)（US）以及US兩側(cè)的末端重復(fù)序列（TR）和內(nèi)部重復(fù)序列（IR）所組成[1]。國內(nèi)外對PRV分子生物學(xué)方面的研究越來越深入，其中TK是PRV的非必需基因和主要毒力基因，它與病毒在機(jī)體中的潛伏感染和在神經(jīng)組織中的增殖有關(guān)[2]。TK基因已知與病毒烈性感染后建立神經(jīng)潛伏性感染有關(guān)，而TK基因部分缺失的PRV病毒盡管在細(xì)胞水平上其復(fù)制能力變化不大，但對5～6周齡的仔豬毒力則大大降低[3]。因此，TK基因是PRV減毒疫苗株構(gòu)建的一個(gè)理想靶標(biāo)。

Overlap PCR是利用PCR技術(shù)的原理，將兩段含有重疊序列的片段連接起來的一種PCR衍生技術(shù)。在Overlap PCR反應(yīng)中，兩個(gè)片段相互重疊配對的區(qū)域作為雙鏈模版，以沒有配對的非重疊區(qū)域作為引物，向兩側(cè)延伸補(bǔ)平到單鏈區(qū)末端，即可獲得包含兩個(gè)片段序列的全長PCR產(chǎn)物。Overlap PCR技術(shù)作為一種簡單快速的技術(shù)手段，在定點(diǎn)缺失突變實(shí)驗(yàn)中得到了廣泛應(yīng)用[4-5]。本研究應(yīng)用Overlap PCR技術(shù)擴(kuò)增PRV SA株的TK基因，構(gòu)建轉(zhuǎn)移重組載體質(zhì)粒，為研制以PRV為載體的活載體多價(jià)基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、載體和轉(zhuǎn)化菌

PRV SA 株、pBluescript SK（+）載體、大腸桿菌DH5α、BHK細(xì)胞均由本院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；PMD18-T載體購自寶生物（大連）有限公司。

1.2 試劑及工具酶

逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV、LA Taq 酶、dNTP、2×GC buffer、HindⅢ、BamHⅠ等限制酶和T4 DNA連接酶購自寶生物（大連）有限公司；DNA回收試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；LipofectamineTM2000購自invitrogen公司；低熔點(diǎn)瓊脂糖購自Sigma；其它細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自Hyclone公司。

1.3 引物的設(shè)計(jì)

為了使TK同源臂足夠長從而提高同源重組的效率，我們將同源臂分別向上和向下延伸至TK基因上游和下游的UL26和gH區(qū)，設(shè)計(jì)引物分別進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物如表1所示。

?

1.4 RNA的提取及TK基因的擴(kuò)增

按照QIAGEN公司的RNA提取試劑盒說明參考，所有器皿和試劑均經(jīng)0.1%的DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液去RNase處理?？紤]到PRV基因組GC含量高的特性，我們采用Takara公司的LA Taq高保真酶和專門用于擴(kuò)增高GC含量DNA模版的GC buffer來進(jìn)行擴(kuò)增。第一步PCR反應(yīng)擴(kuò)增兩個(gè)同源臂的反應(yīng)體系為：2×GC buffer 12.5 μL，dNTP 2 μL，上游下游引物各0.5 μL，PRV基因組DNA 2 μL，LA Taq 聚合酶 0.5 μL，補(bǔ)水到 25 μL。反應(yīng)循環(huán)條件為：95℃1 min；68℃1 min；72℃1 min共35個(gè)循環(huán)。在反應(yīng)前可以把反應(yīng)混合物（聚合酶除外）于99℃預(yù)變性5 min。

用凝膠回收試劑盒將兩個(gè)同源臂PCR擴(kuò)增片段產(chǎn)物回收后，即可進(jìn)行第二步的Overlap PCR。反應(yīng)體系為：2×GC buffer 12.5 μL，dNTP 2 μL，回收同源臂片段（10倍稀釋）各1 μL，ExTaq聚合酶0.5 μL，補(bǔ)水到24 μL，（這里我們先不加引物讓兩個(gè)片段相互重疊延伸補(bǔ)平）反應(yīng)條件為：95℃1 min；70℃30 s；72℃2 min 3個(gè)循環(huán)，然后95℃1 min；65℃30 s；72℃2 min 3個(gè)循環(huán)，最后95℃1 min；60℃30 s；72℃2 min 4個(gè)循環(huán)，這時(shí)我們補(bǔ)加TK-L-F和TK-R-R兩個(gè)引物各0.5 μL，達(dá)到總體積25 μL，再進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：95℃45 s；70℃30 s；72 ℃ 2 min 10 個(gè)循環(huán)然后 95 ℃ 45 s；68 ℃ 30 s；72℃2 min 25個(gè)循環(huán)。經(jīng)過回收，酶切，連接克隆載體PMD18-T vector，送寶生物（大連）公司測序。

1.5 TK轉(zhuǎn)移重組載體的構(gòu)建及鑒定

將質(zhì)粒pMD-TK和真核表達(dá)載體pBluescript SK（+）用BamHI和HindⅢ分別酶切，對雙酶切后帶有BamHI和HindⅢ酶切位點(diǎn)的目的片斷和pBluescript SK（+）用凝膠回收試劑盒回收。用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，將初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒pBTK送往大連寶生物工程有限公司測序。

1.6 體外轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒與PRV基因組

按照LipofectamineTM2000產(chǎn)品說明書，通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法用重組表達(dá)質(zhì)粒pBTK和PRV SA基因組共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)良好的單層BHK-21細(xì)胞，以正常生長的BHK-21細(xì)胞為非轉(zhuǎn)染空白對照組。觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞病變形成情況。轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解后盲傳兩代，仍有細(xì)胞病變，初步判斷重組病毒拯救成功。將感染重組病毒的細(xì)胞用胰酶消化后，利用PBS洗滌3次，4000 rmp離心棄上清。提取細(xì)胞DNA，PCR檢測目的基因。

1.7 空斑純化

將出現(xiàn)細(xì)胞病變的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)物反復(fù)凍融3次，10-2～10-7稀釋，分別取400 μL接種至長滿單層的BHK細(xì)胞上，37℃吸附1 h，吸棄培養(yǎng)液，用無鈣鎂的PBS洗滌3次，每孔覆蓋低熔點(diǎn)瓊脂糖2.5 mL，37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察，待空斑形成后，用0.01%中性紅溶液染色，37℃作用2 h，挑取空斑接于長滿單層細(xì)胞的24孔板中，觀察病變，收毒，-20℃保存。對陽性株進(jìn)行連續(xù)傳代，觀察突變株的遺傳穩(wěn)定性，計(jì)算TCID50毒價(jià)。

1.8 重組病毒遺傳穩(wěn)定性檢測

將初次篩選獲得的初代pBTK重組病毒在BHK細(xì)胞上連續(xù)傳代，提取陽性細(xì)胞的基因組DNA，PCR檢測目的基因，同時(shí)設(shè)空載體細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的BHK細(xì)胞作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 TK基因PCR擴(kuò)增

凝膠電泳顯示TKL、TKR基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物條帶分別為886 bp、911 bp，與預(yù)期結(jié)果符合。經(jīng)過這一步的PCR，我們成功獲得了兩個(gè)同源臂片段（圖1）。經(jīng)過Overlap PCR，我們成功擴(kuò)增出了長度1814 bp的目的片段（圖2）。

2.2 重組載體pBTK的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pBTK進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，獲得的片斷與預(yù)期大小一致；pBTK載體經(jīng)HindⅢ/BamHI酶切獲得一條約為1814 bp的片斷（圖3，4）。測序結(jié)果顯示，TK基因的讀碼框正確，表明TK基因已成功插入到pBTK載體中。

2.3 體外轉(zhuǎn)染與空斑篩選結(jié)果

通過脂質(zhì)體介導(dǎo)法，以構(gòu)建好的質(zhì)粒pBTK與PRV基因組共轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，待病變后收取細(xì)胞液。各取100 μL接于長滿單層的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，出現(xiàn)病變后收毒。分別取200 μL制備病毒模板，經(jīng)PCR篩選陽性株（圖5）。將檢測為陽性的共轉(zhuǎn)染產(chǎn)物反復(fù)凍融3次，梯度稀釋后分別取400 μL接于長滿單層的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，做空斑篩選。挑取空斑接于長滿單層的24孔板中，病變后收毒。取200 μL制成模板進(jìn)行PCR篩選，選取陽性株如此重復(fù)篩選直至陽性率達(dá)100%為止。將陽性突變株接種BHK細(xì)胞，接種后24 h觀察，病變后收毒，連續(xù)傳代12次后，細(xì)胞病變穩(wěn)定，測得TCID50毒價(jià)是5.75，表明構(gòu)建的雙基因缺失突變株毒價(jià)減弱且遺傳穩(wěn)定。

2.4 TK基因的遺傳穩(wěn)定性檢測

篩選出的第 1、2、5、8、10、15 代整合的 BHK 細(xì)胞均可擴(kuò)增出1814 bp大小相符的條帶，而所設(shè)同批次對照沒有擴(kuò)增出條帶（圖6）。

3 討論

疫苗接種是防制偽狂犬病的重要手段之一。常規(guī)疫苗在接種后雖然能預(yù)防臨床癥狀的出現(xiàn)，但不能防止強(qiáng)毒在被感染動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制、排毒?；蛉笔б呙缭赑RV根除計(jì)劃中占重要作用，在美國和各歐共體成員國及中國臺(tái)灣地區(qū)推廣的偽狂犬根除計(jì)劃中，以及目前的商品化基因缺失疫苗中，TK基因和GE基因的缺失被認(rèn)為是安全和有效的[6-7]。TK基因缺失疫苗是最早的基因工程缺失疫苗，已成為商品疫苗。世界上第一個(gè)獲得批準(zhǔn)使用的基因工程致弱活疫苗就是偽狂犬的TK 缺失疫苗株BUK-d13[8-10]。該TK株在細(xì)胞培養(yǎng)上，即使在含有HAT的選擇條件下，也不能回復(fù)為TK+，對小鼠、雞、兔和綿羊的毒力和親神經(jīng)性與BUK相比大大降低，對豬不僅無毒力而且有較好的免疫原性。TK基因缺失后的病毒同野毒株一樣在培養(yǎng)細(xì)胞上增殖良好，但毒力和潛伏感染的能力大大降低。研究發(fā)現(xiàn)，其構(gòu)建的TK缺失重組病毒與SA株在PK-15上形成的空斑大小進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者無明顯差別，這與陳煥春等實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[11]。

偽狂犬病毒基因缺失疫苗重組病毒株構(gòu)建的經(jīng)典方法可分為三個(gè)步驟：首先構(gòu)建要缺失基因的一左一右兩個(gè)同源臂，缺失即在這一步引入，將同源臂連接到轉(zhuǎn)移載體上；第二步，通過將PRV基因組DNA和含有同源臂的轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染PRV易感細(xì)胞，通過細(xì)胞內(nèi)的同源重組，同源臂和原始病毒基因組對應(yīng)片段互換，即產(chǎn)生基因特定缺失的重組病毒；最后通過擴(kuò)增和空斑篩選，即可獲得含有缺失的重組病毒。其中第一個(gè)步驟，構(gòu)建缺失轉(zhuǎn)移載體步驟是最基本也是最重要的一步，選取哪一段基因用于缺失和同源臂構(gòu)建不僅會(huì)影響第二步的同源重組的效率，也決定了缺失重組病毒疫苗株的免疫效果。

最早的構(gòu)建同源臂的方法是利用病毒基因組DNA上本身含有的特異性限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，用選定的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，即可獲得所需要的基因組片段即同源臂。這種方法需要提取大量的病毒基因組DNA用來酶切，且所需要的同源臂基因組片段不一定正好含有可利用的特定酶切位點(diǎn)，因此實(shí)際應(yīng)用具有很大的局限性。PCR方法的出現(xiàn)為同源臂的構(gòu)建提供了新的思路：通過設(shè)計(jì)特異性的引物，可以把選定的病毒基因片段即同源臂擴(kuò)增出來，將兩個(gè)同源臂片段依次插入克隆載體中，即可獲得轉(zhuǎn)移載體[12-13]。但這樣的技術(shù)路線實(shí)際應(yīng)用中也會(huì)遇到同源臂片段中含有酶切位點(diǎn)與克隆用酶切位點(diǎn)沖突的情況，這時(shí)候就必須通過定點(diǎn)突變將同源臂中發(fā)生沖突的核苷酸位點(diǎn)置換，才能進(jìn)行克隆連接。正是基于此問題的存在，我們利用重疊延伸PCR的技術(shù)手段對原來采用的方法進(jìn)行一些改進(jìn)。

由于PRV基因組DNA為150 kb，G+C含量達(dá)73%以上，局部G+C含量高達(dá)97%，復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)經(jīng)常影響PCR擴(kuò)增，對測序反應(yīng)也提出了更高的要求。本研究通過采用不同條件，如退火溫度、聚合酶的選擇、循環(huán)數(shù)、冰上配制反應(yīng)體系、熱啟動(dòng)等，最終高保真的擴(kuò)增出TK基因。研究結(jié)果表明，兩同源臂在TK基因中相距750bp，重組病毒在BHK-21細(xì)胞傳15代后，PCR檢測其缺失不變。TK 基因缺失后的突變株同野毒株P(guān)RV Sa株一樣在培養(yǎng)細(xì)胞上增殖良好，遺傳穩(wěn)定，噬斑大小無明顯區(qū)別，但致細(xì)胞病變能力有所降低，TCID50毒價(jià)下降至5.75。下一步將利用小鼠等進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步研究，為研制以PRV為載體的活載體多價(jià)基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

[1]Marchioli C C，Yancey R J Jr，Wardley R C，et al.A vaccine strain of pseudorabies virus with deletions in the thymidine kinase and glycoprotein X genes[J].Am JVetRes， 1987， 48（11）：1577-1583.

[2]Lisa E，Pomeranz A，Shley E，et al.Molecular Biology of Pseudorabies Virus：Impact on Neurovirology and Veterinary Medicine[J].Microbiol Mol Biol Rev，2005，69（3）：462-500.

[3]Jacobs L，Rziha H J，Kimman T G，et al.Deleting valine-125 and cysteine-126 in glycoprotein gIofpseudorabiesvirusstrain NIA-3 decreasesplaque size and reduces virulence in mice[J].Arch Virol，1993，131（3-4）：251-264.

[4]Quint W，Gielkens A，Van Van Oirschot J，et al.Construction and Characterization ofDeletion Mutants of Pseudorabies Virus:a New Generation of ‘Live’Vaccines[J].J Gen Virol，1987，68：523-534.

[5]Song Y F，Jin M L，Zhang S L，et al.Generation and immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing cap protein of porcine circovirus type 2[J].Vet Microbiol，2007，119（1）：97-104.

[6]Jacobs L， Rziha H J， Kimman T G，et al.Glycoprotein Iofpseudorabiesvirus（Aujeszky's disease virus）determines virulence and facilitates penetration of the virus into the central nervous system of pigs[J].Acta Vet Hung，1994，42（2-3）：289-300

[7]Kinker D R，Swenson S L，Wu L L，et al，E-valuation of serological tests for the detection of pseudorabies gE antibodies during early infection[J].Vet Microbiol.1997，55（1-4）：99-106.

[8]Kit S，Kit M，Pirtle E C.Attenuated properties of thymidine kinase-negative （TK-）pseudorabies virus to challenge infection with virulent virus[J].Comp Immunol Microbiol Infect Res，1985，23（1）：15-26.

[9]Willeberg P，Leontides L，Ewald C，et al.Effect of vaccination against Aujeszky’s disease compared with test and slaughter programme：epidemiologicaland economicalevaluations [J].Acta Vet Scand Suppl，1996，90：25-51.

[10]Nauwynck H，Glorieux S，F(xiàn)avoreel H，et al.Cell biological and molecular characteristics of pseudorabies virus infections in cell cultures and in pigs with emphasis on the respiratory tract[J].Vet Res，2007，38（2）：229-241.

[11]陳煥春，周復(fù)春，方六榮，等.偽狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-、LacZ-+突變株的構(gòu)建 [J].病毒學(xué)報(bào)，2001，17（1）：69-74.

[12]郭廣君，呂素芳，沈志強(qiáng)，等.山東省分離強(qiáng)毒株豬偽狂犬病病毒SA株TK基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2009（8）：76-79.

[13]Heckman K L，Pease L R.Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension[J].Nature Protocols，2007，2：924-932.