張 梅，趙 雨，李蕓彤，徐云鳳，曲曉波

長春中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥與生物工程研發(fā)中心，長春 130117

哈蟆油(Oviductus Ranae)是中國雌性林蛙(Rana temporaria chensinensis David)的干燥輸卵管[1]。據(jù)報道，哈蟆油具有促進卵泡早熟及卵泡增殖作用，對性周期有明顯的影響，可延長興奮期，有良好的強精作用；同時具有補虛、退熱之功效，可用于治療精血不足、體虛氣弱、肺虛咳、神經衰弱、記憶減退、產后無乳以及肺結核、肝炎等消耗性疾病[2-3]。哈蟆油遇水膨脹后黏稠度很大，水溶性較低，不利于人體吸收及產品加工。哈蟆油的主要成分是蛋白質，約占60%[4-5]。本研究采用堿性蛋白酶制備了低粘度、高溶解性的哈蟆油酶解物，同時進行了抗疲勞、耐缺氧、降血脂等相關藥理活性研究，為哈蟆油的進一步研究和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

DS-1型組織勻漿器(上海正慧工貿有限公司)；HH.S21-8-S型恒溫水浴鍋(上海躍進醫(yī)療器械廠)；TDL-5-A型離心機 (上海安亭科學儀器廠)；LL3000型冷凍干燥機(德國Heto公司)；DV-Ⅱ+P型旋轉粘度計（Brookfield 公司）；游泳箱(50cm×40cm×35 cm)。

堿性蛋白酶(Sigma公司)；血清總膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒均購自上海科欣生物技術研究所。

1.2 藥材

哈蟆油購于吉林省白山市北亞藥業(yè)，經本校中藥鑒定教研室姜大成教授鑒定為中國林蛙(Rana temporaria chensinensis David)雌蛙的干燥輸卵管。

1.3 試驗動物

SPF級BALB/C種雄性小鼠140只，體重為(20±2)g，Wistar 雄性大鼠 96 只，體重為(180±20)g，購于吉林大學實驗動物中心，合格證號：SCXK—（吉）2008—0005。

2 方法與結果

2.1 哈蟆油酶解物的制備

哈蟆油去除筋膜等雜質后晾干，研磨成粉末，精確稱取100.0 g粉末，蒸餾水發(fā)制24 h后勻漿。加熱煮沸4 h，冷卻至室溫，調節(jié)pH值為8.5。按酶與底物濃度為1000U·g-1加入堿性蛋白酶，60℃酶解30min，加熱煮沸10 min滅酶活。5000 r·min-1離心20 min，取其上清液，真空冷凍干燥，凍干品即為哈蟆油酶解物，凍干品收率為87.2%。酶解后的哈蟆油由最初粘度3127 mPa.s降為8.86 mPa.s；Folin-酚法測其蛋白含量為57.4%；硫酸-苯酚法測其糖含量為25.3%。

2.2 哈蟆油酶解物抗疲勞試驗

小鼠70只，隨機等分為7組(n=10)，即哈蟆油及其酶解物低、中、高劑量組(0.15、0.3、0.6 g·kg-1)和空白對照組，空白對照組給予等體積的蒸餾水。每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥30 d。末次給予受試樣品30 min后，將尾根部負荷5%體重鉛皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深約30 cm，水溫(25±1.0)℃，記錄小鼠自游泳開始至死亡的時間，即小鼠負重游泳時間。記錄試驗數(shù)據(jù)并進行方差分析。

由表1可知，酶解前后各劑量組與對照組比較均能延長小鼠游泳時間，酶解前低劑量組延長具有顯著性意義(P＜0.05)，酶解后各劑量組延長均無顯著性意義 (P＞0.05)。表明哈蟆油具有一定的抗疲勞作用，而酶解物抗疲勞作用不明顯。

2.3 哈蟆油酶解前后的耐缺氧試驗

末次給藥1 h后，將各組小鼠逐只放入盛有5 g鈉石灰的250 mL磨口瓶內，每瓶1只，加蓋，以凡士林密封瓶口，旋緊密封，立即計時，以呼吸停止時間為指標，觀察小鼠因缺氧而死亡時間，記錄試驗數(shù)據(jù)并進行方差分析。

由表1可知，酶解前后各劑量組與對照組比較均能延長小鼠常壓耐缺氧存活時間；酶解前各劑量組無顯著性意義(P＞0.05)；酶解后各劑量組具有顯著性意義(P＜0.05)。表明哈蟆油酶解物能明顯增強小鼠耐缺氧能力，減少缺氧對機體重要器官功能的影響。

2.4 哈蟆油酶解物輔助降血脂試驗

2.4.1 大鼠分組與給藥大鼠適應性飼養(yǎng)觀察5 d，取尾靜脈血測定TC、TG和HDL-C等各項血脂指標。將大鼠隨機分為8組，每組12只，并適當調整使各組大鼠的TG、HDL-C及初始體重盡可能均衡。設基礎飼料對照組，高脂模型對照組（高脂組），蛤蟆油及其酶解物低、中、高3個劑量的試驗組（劑量分別為 0.05、0.1、0.2 g·kg-1）?；A飼料對照組給予合成飼料，高脂組給予高脂飼料，受試各劑量組在給予高脂飼料的同時給予受試藥物。每周稱重一次，并根據(jù)體重調整給藥量。灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥30 d。

表1 哈蟆油及其酶解物對小鼠負重游泳時間和小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響(n=10,±s)

表1 哈蟆油及其酶解物對小鼠負重游泳時間和小鼠常壓耐缺氧存活時間的影響(n=10,±s)

注：*與對照組相比P＜0.05，表示差異顯著。

2.4.2 測定指標依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》2003版[6]相關規(guī)定，采用脂代謝紊亂模型法-預防性給受試樣品，試驗至第30 d取血，采用酶聯(lián)法測定TC、TG和HDL-C含量，采血前動物禁食16 h，記錄試驗數(shù)據(jù)并進行方差分析。

由表2可知，試驗前對照組、高脂組及各劑量組各項指標均無顯著性差異。實驗后高脂組與對照組比較，TC、TG含量均比對照組升高，且具有顯著性差異(P＜0.05)，表明高脂模型組建模成功。

表2 哈蟆油酶解物對大鼠血脂的影響(n=12，±s)

表2 哈蟆油酶解物對大鼠血脂的影響(n=12，±s)

注：*與高脂模型組相比P＜0.05，#與基礎對照組相比P＜0.05，表示差異顯著。

實驗后各用藥組與高脂模型組比較，各劑量組TC含量均降低，且蛤蟆油及其酶解物低、高劑量組TC含量降低具有顯著性意義(P＜0.05)；各劑量組TG含量降低也具有顯著性差異(P＜0.05)。表明哈蟆油酶解物具有輔助降血脂的作用。

3 討 論

運動耐力的提高是抗疲勞能力增強的最有力表現(xiàn)，游泳時間的長短可以反映運動疲勞的程度[7]。提高機體的耐缺氧能力，就是要通過降低機體缺氧應激強度、促進缺氧適應等手段，減弱缺氧對機體的損傷，使機體在長期缺氧環(huán)境中盡可能維持較正常的生理機能[8]。現(xiàn)有研究表明，血脂在維持人體正常生理活動中發(fā)揮重要作用[9-10]。而血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平是反映機體脂質代謝的主要指標。

采用酶法水解蛋白，即可以產生大量具有多種生物功能的多肽，同時反應底物、反應劑和反應環(huán)境沒有污染[11]。本研究通過對哈蟆油酶解物的抗疲勞、耐缺氧及降血脂作用的研究，表明哈蟆油酶解物能延長小鼠負重游泳時間及缺氧小鼠的存活時間，提高小鼠耐缺氧能力，維持小鼠較正常的生理機能；同時，哈蟆油酶解物各劑量組對甘油三酯含量的降低均具有顯著性意義，其中低、中劑量組尤為顯著，高劑量組效果次之，為考察降低甘油三酯量效關系提供了一定的實驗基礎；哈蟆油酶解物也能顯著降低大鼠血清總膽固醇含量，根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)[6]，在血清總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇三項指標檢測中血清總膽固醇和甘油三酯二項指標陽性，可判定該哈蟆油酶解物保留了蛤蟆油的輔助降血脂功能，為哈蟆油保健產品的研究與開發(fā)奠定了基礎。

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