吳航宇,林 琳,李 蕾,陳大舟

(1.北京化工大學(xué)理學(xué)院,北京 100029;2.中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院化學(xué)計(jì)量與分析科學(xué)研究所,北京 100013)

穩(wěn)定同位素試劑廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、食品安全、資源環(huán)境、新型材料、軍事與安全等科學(xué)研究領(lǐng)域[1-2],是同位素示蹤技術(shù)的重要試劑。

傳統(tǒng)的酯化反應(yīng)所采用的催化劑為酸或堿[3],得到的硬脂酸甘油酯通常是一酯、二酯和三酯的混合物,需要繁瑣的提純過程,不適合價(jià)格昂貴的13C標(biāo)記化合物的合成。為此,本工作擬采用Lipozyme酶作為催化劑,利用酶的高選擇性直接合成三酯,同時(shí)在反應(yīng)體系中不會(huì)引入其他溶劑[4-6],所得產(chǎn)物無需純化。

1 主要儀器與試劑

傅立葉VECTDR22型紅外光譜儀(KBr壓片)、AV 600核磁共振儀(溶劑為 CDCl3):德國(guó)Bruker公司;PYRIS I型差示掃描量熱儀(氮?dú)獗Ｗo(hù)):美國(guó)Perkinelmer公司;MAT 900XL型雙聚焦高分辨質(zhì)譜儀:配電子轟擊(EI)離子源,美國(guó)THERMO FINNIGAN公司。

13C3-甘油(13C同位素豐度為 99%):美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司;硬脂酸(99%):美國(guó) Alfa Aesar公司;Lipozyme 酶 :美國(guó)Sigma公司;三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品:北京西中化工廠。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 13 C3-三硬脂酸甘油酯的合成

13C3-三硬脂酸甘油酯的合成路線示于圖1[5]。

圖1 13 C3-三硬脂酸甘油酯的合成路線

將13C3-甘油和硬脂酸按一定摩爾比混合置于50 mL圓底燒瓶中,放入恒溫水浴加熱磁力攪拌器中,開啟攪拌使反應(yīng)物混合均勻并加熱,待反應(yīng)物完全熔融,保持15 min,加入催化劑Lipozyme酶,采用抽真空的方式去除產(chǎn)物中的水,恒溫水浴反應(yīng)一定時(shí)間,不經(jīng)過提純,熱過濾將產(chǎn)物與酶分離,即得到產(chǎn)物13C3-三硬脂酸甘油酯。烘干、稱重,計(jì)算產(chǎn)率。

由于13C同位素產(chǎn)品價(jià)格昂貴,本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)未標(biāo)記三硬脂酸甘油酯的合成條件進(jìn)行探索,分別考察反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)物比例、催化劑用量和反應(yīng)方式對(duì)三硬脂酸甘油酯純度的影響,確定最佳合成條件。此后,將原料替換成13C同位素產(chǎn)品,在最佳條件下合成13C3-三硬脂酸甘油酯。

2.2 結(jié)構(gòu)表征方法

采用差示掃描量熱分析(DSC)確定產(chǎn)物熔點(diǎn),分別采用質(zhì)譜、核磁共振和傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行表征。

DSC分析條件:升溫范圍40～120℃,升溫速率10 ℃/min,載氣(N 2)流速1.2 mL/min。

質(zhì)譜條件:電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV,傳輸線溫度275℃,離子源溫度200℃,激活電壓1.5 V,質(zhì)量掃描范圍(m/z)35～700。

核磁共振分析條件:液體高分辨NMR 600 MHz,優(yōu)質(zhì)核磁管(φ5 mm:0.6 mL或 4 cm),CDCl3溶劑。

FT-IR分析條件:測(cè)定波數(shù)范圍為 500～3 000 cm-1,參比物為空氣,掃描次數(shù)32或16,分辨率8或4 cm-1。

3 結(jié)果與討論

3.1 合成條件優(yōu)化

3.1.1 反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)時(shí)間對(duì)三硬脂酸甘油酯純度的影響示于圖2。由圖2可知,三硬脂酸甘油酯的純度隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增大,10 h后反應(yīng)基本達(dá)到平衡。為避免催化劑Lipozyme酶長(zhǎng)時(shí)間處在高溫下及副產(chǎn)物的生成,確定最佳反應(yīng)時(shí)間為25 h。產(chǎn)物純度為98.4%。

圖2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)三硬脂酸甘油酯純度的影響

3.1.2 反應(yīng)溫度

反應(yīng)物硬脂酸的熔點(diǎn)為68～72℃,為了保證反應(yīng)物的熔融狀態(tài),條件實(shí)驗(yàn)中選擇反應(yīng)溫度為75、80和85℃。此溫度下合成的對(duì)三硬脂酸甘油酯的純度示于圖3。催化反應(yīng)速率隨著溫度升高而加速,在75～80℃時(shí),三硬脂酸甘油酯的純度隨溫度升高呈增大趨勢(shì);酶在高溫下會(huì)失活,80～85℃時(shí),三硬脂酸甘油酯的純度下降。因此,確定最佳反應(yīng)溫度為80℃。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)三硬脂酸甘油酯純度的影響

3.1.3 硬脂酸與甘油的摩爾比

反應(yīng)物比例對(duì)三硬脂酸甘油酯純度的影響示于圖4。由圖4可知,硬脂酸與甘油摩爾比為2.8∶1時(shí),生成的三硬脂酸甘油酯的純度高于摩爾比為3.0∶1時(shí)的純度。但隨著甘油用量的進(jìn)一步增加,這是由于甘油用量增加后,三硬脂酸甘油酯的純度呈下降趨勢(shì),會(huì)導(dǎo)致副產(chǎn)物雙甘酯、單甘酯的生成。因此,確定硬脂酸與甘油的摩爾比最佳摩爾比為2.8∶1。

圖4 反應(yīng)物比例對(duì)三硬脂酸甘油酯純度的影響

3.1.4 催化劑用量

圖5 催化劑用量對(duì)三硬脂酸甘油酯純度的影響

催化劑用量對(duì)三硬脂酸甘油酯純度的影響示于圖5。由圖5可知,三硬脂酸甘油酯的純度隨著酶用量的增加而增大,當(dāng)酶用量加到底物含量的3.6%時(shí),反應(yīng)基本達(dá)平衡。比較含酶量7.6%、5.6%、3.6%時(shí)產(chǎn)物的純度可見,含酶量為7.6%的三硬脂酸甘油酯純度略高(98.4%),考慮到產(chǎn)品質(zhì)量和能源消耗,選擇最佳催化劑用量為底物含量的7.6%。

3.1.5 反應(yīng)方式

酯化反應(yīng)是可逆反應(yīng),除去產(chǎn)物水可以促使反應(yīng)向正向進(jìn)行。采用抽真空、敞口自然蒸發(fā)及封閉反應(yīng)3種反應(yīng)方式分別進(jìn)行5組三硬酯酸甘油酯的合成,其他條件不變,結(jié)果顯示,抽真空反應(yīng)方式下,產(chǎn)物純度最高,為98.27%;敝口自然反應(yīng)方式次之,為96.14%;封閉反應(yīng)方式產(chǎn)物純度最低,為91.93%。說明用抽真空的反應(yīng)方式可以更有效地去除水分。因此,最佳的反應(yīng)方式為抽真空。

綜上所述,三硬脂酸甘油酯合成的最佳條件為:硬脂酸與甘油摩爾比為2.8∶1,催化劑Lipozyme酶用量為底物總質(zhì)量的7.6%,反應(yīng)時(shí)間為25 h,反應(yīng)溫度為80℃,反應(yīng)過程中抽真空。最佳條件下,三硬脂酸甘油酯的合成產(chǎn)率為80%。

3.2 結(jié)構(gòu)表征

3.2.1 FT-IR分析

13C3-三硬脂酸甘油酯產(chǎn)品和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的FT-IR譜圖示于圖6。

由圖6可知,13C3-三硬脂酸甘油酯產(chǎn)品和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的主要特征峰均吻合。其中,2 926 cm-1和2 854 cm-1為脂肪族-CH-不對(duì)稱振動(dòng)吸收峰;1 737 cm-1為酯基的C=O的特征吸收峰;1 179 cm-1和1 113 cm-1為酯基的C-O-C特征吸收峰;1 467 cm-1為脂肪族-CH 2-剪式振動(dòng);717 cm-1為脂肪族-(CH 2)n-的平面搖擺振動(dòng)。利用OPUS譜圖檢索軟件,將產(chǎn)品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì),得到匹配度為92.3%。以上結(jié)果表明,產(chǎn)物為13C-三硬脂酸甘油酯。

圖6 13 C3-三硬脂酸甘油酯的FT-IR譜圖a——合成產(chǎn)物;b——三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品

3.2.2 核磁共振譜(1H NMR、13CNMR)

13C3-三硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR譜圖數(shù)據(jù)列于表1。

由于13C標(biāo)記的化合物中,13C(自旋量子數(shù)I=1/2)會(huì)對(duì)同碳上的H(1J偶合)或鄰碳上的H(2J偶合)存在耦合,且同碳耦合,耦合常數(shù)較大,一般大于100 Hz。由表 1可知,產(chǎn)物 δ=5.26,δ=4.29,δ=4.13處13C 對(duì) H 均存在明顯的裂分,且其耦合常數(shù) J分別為 148.8 Hz,148.8 Hz和151.1 Hz。而對(duì)應(yīng)的三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品 δ=5.26,δ=4.28和 δ4.14處均無相關(guān)裂分。以上結(jié)果表明,合成產(chǎn)物為13C3-三硬脂酸甘油酯。

13C3-三硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的13C NMR譜圖數(shù)據(jù)列于表2。

表1 13 C3-三硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR

表2 13 C3-三硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的13 C NMR

與1H NMR結(jié)果相似,在13C標(biāo)記化合物的13C NMR譜圖上同樣存在著13C對(duì)相鄰碳的耦合。由表2可知,產(chǎn)物在δ=68.8和δ=62.1處均存在明顯的耦合。δ=68.8處對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)為甘油酯中間的碳C-b,δ=62.1處對(duì)應(yīng)官能團(tuán)為兩端的碳C-a,其中C-a化學(xué)環(huán)境相同,皆對(duì)C-b存在耦合,使得 C-b生成三重峰(J=43.7 Hz),同時(shí)C-a受C-b耦合生成雙峰(J=43.7 Hz)。而在未標(biāo)記的13C NMR譜圖中,化學(xué)位移δ=68.8和δ=62.1處呈現(xiàn)的則是兩個(gè)單峰。因此進(jìn)一步證明合成產(chǎn)物為13C3-三硬脂酸甘油酯。

3.2.3 質(zhì)譜(MS)

13C3-三硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果列于表3。

表3 13C3-三硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)譜裂解碎片離子

在質(zhì)譜分析中,[RCO]+、[M-RCOO]+、[RCO+74]+以及[RCO+128]+是4類用于鑒定三硬脂酸甘油酯的碎片離子[8]。由表 3可知,13C3-三硬脂酸甘油酯上述特征離子m/z分別為 267、344、398、610,而非標(biāo)記三硬脂酸甘油酯m/z分別為264、341、395和 607,兩者對(duì)比,m/z相差3,這是因?yàn)橛?3C3同位素的存在。此結(jié)果說明合成的標(biāo)記產(chǎn)物為13C3-三硬脂酸甘油酯。

根據(jù)質(zhì)譜峰強(qiáng)度可計(jì)算產(chǎn)物13C3-三硬脂酸甘油酯中的13C豐度。計(jì)算公式為13C豐度=[I M+3/(I M+I M+3)]×100%(I為碎片離子強(qiáng)度),利用質(zhì)量數(shù)398計(jì)算13C豐度,計(jì)算結(jié)果列于表4。由表4可見,13C豐度為99.49%。

表4 根據(jù)質(zhì)譜峰強(qiáng)度計(jì)算13 C3-三硬脂酸甘油酯中13 C的豐度

3.2.4 產(chǎn)物熔點(diǎn)測(cè)定

13C3-三硬脂酸甘油酯和三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的差示掃描量熱分析(DSC)譜圖示于圖7。由圖7可知,合成的產(chǎn)物熔點(diǎn)為56.496℃,三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品的熔點(diǎn)為59.669℃,均在三硬脂酸甘油酯熔點(diǎn)范圍53～62℃[7]內(nèi),說明合成的產(chǎn)物為三硬脂酸甘油酯。根據(jù)圖7計(jì)算得其化學(xué)純度＞98%。

圖7 13 C3-三硬脂酸甘油酯的DSC譜圖a——合成產(chǎn)物 ;b——三硬脂酸甘油酯標(biāo)準(zhǔn)品

3 小 結(jié)

以摩爾比n(硬脂酸)∶n(13C3-甘油)=2.8∶1,采用生物L(fēng)ipozyme酶作為催化劑,在無毒有機(jī)溶劑的存在下,直接酯化合成13C3-三硬脂酸甘油酯,產(chǎn)物無需純化,產(chǎn)率可達(dá)80%。產(chǎn)物經(jīng)差示掃描量熱分析(DSC)、紅外光譜(FT-IR)、核磁共振(1H NMR)、質(zhì)譜(MS)分析表征,結(jié)果表明,合成產(chǎn)物為13C3-三硬脂酸甘油酯,且化學(xué)純度＞98%,同位素豐度＞99%,均符合技術(shù)指標(biāo)要求。與傳統(tǒng)工藝比較,該合成工藝高效、經(jīng)濟(jì)合理,具有重要應(yīng)用價(jià)值。

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