黃華璠,周 浩,黃士堂,褚泰偉

(北京大學化學與分子工程學院放射化學與輻射化學重點學科實驗室北京分子科學國家實驗室,北京 100871)

99Tcm-BnAO作為一種非硝基咪唑類乏氧顯像劑,在臨床上具有乏氧顯像的應用價值[1-4]。然而體外細胞實驗發(fā)現(xiàn),99Tcm-BnAO的乏氧與正常細胞放射性攝取比偏低[5],動物體內(nèi)實驗結果顯示,腫瘤與血的放射性攝取比也較低,達不到顯像的要求[6]。

本工作擬在配體BnAO的側鏈上進行乙二醇獨甲醚的修飾,以期提高BnAO脂溶性,從而達到提高99Tcm-BnAO類顯像劑在腫瘤內(nèi)的攝取率,縮短顯像時間的目的。

1 實驗材料

1.1 主要儀器與裝置

自動γ計數(shù)器:美國Parckard公司;99Mo-99Tcm發(fā)生器:原子高科股份有限公司;APEX IV傅里葉變換高分辨質譜:美國Bruker公司;DY-W1型電泳儀:北京試驗設備廠;核磁共振儀:400 MHz,美國Bruker公司。

1.2 主要材料與試劑

實驗所用試劑均為分析純;99Tcm-BnAO藥盒:北京欣科思達醫(yī)藥科技有限公司;聚酰胺薄層板:浙江臺州市路橋四青生化材料廠。

1.3 動物模型

雄性昆明小鼠:一級,體重20～25 g,由中科院動物所實驗動物室提供;S180細胞株:北京大學生命科學學院提供。在小鼠左腋下移植S180肉瘤,10 d后,腫瘤直徑約1.5 cm時進行動物實驗。

2 實驗方法

2.1 BnAO-乙二醇獨甲醚的合成

BnAO及BnAO-乙二醇獨甲醚化學結構示于圖1,BnAO-乙二醇獨甲醚的合成路線示于圖 2 。[7-8]

圖1 BnAO及BnAO-乙二醇獨甲醚的結構

于150 mL乙醚中加入9.97 g 3-甲基-2-烯-1-丁醇,冷卻至-5℃。逐滴加入15 mL PBr3并保持溫度在0℃以下,電磁攪拌45 min。逐滴緩慢加入100 mL NaCl溶液淬滅反應。分離出有機相,用Na2 SO4干燥,于常溫下減壓旋蒸,得到產(chǎn)物 1-溴-3-甲基-2-丁烯約 4.5 g,產(chǎn)率約80%。

圖2 BnAO-乙二醇獨甲醚的合成路線

2.4 mL乙二醇獨甲醚溶于 10 mL無水THF,逐份加入共 0.6 g NaH,于室溫攪拌15 min。再加入0.8 mL產(chǎn)物 1-溴-3-甲基-2-丁烯,室溫攪拌1 h。減壓蒸餾,殘留物溶于二氯甲烷。過濾溶液,用10 mL稀鹽水洗滌。分離出有機相,用MgSO4干燥,減壓蒸餾。殘留物用柱色譜純化,展開劑為V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=10∶1,得到產(chǎn)物1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-丁烯約0.5 g。產(chǎn)率約40%。

1 g 1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-丁烯和1.2 mL亞硝酸異戊酯用干冰丙酮浴冷卻至-30℃,劇烈攪拌均勻。在 1 h內(nèi)逐滴加入1 mL冷卻的1 mol/L HCl,再攪拌 2 h。整個過程中保持溫度＜-20℃。在低溫下真空抽濾反應物,沉淀用10 mL冷乙醚洗滌,得到產(chǎn)物3-氯-1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-亞硝基丁烷約0.35 g,產(chǎn)率約25%。

于1.0 mL乙腈中加入0.3 mL二異丙基乙基胺,再加入200 mg 3-氯-1-(2-甲氧基乙氧基)-3-甲基-2-亞硝基丁烷以及40 mg 1,4-丁二胺。于室溫反應17 h。過濾反應物,用5 mL去離子水洗滌沉淀,用乙腈重結晶,得到最終產(chǎn)物BnAO-乙二醇獨甲醚約86 mg,產(chǎn)率約40%。

2.2 99Tcm-BnAO及99 Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚的制備

99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚的制備:用0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液作為緩沖溶液,加入50μg BnAO-乙二醇獨甲醚、25μg酒石酸鈉、1μg SnCl2、0.1 mL99TcmO4-,于 75 ℃下反應10 min。薄層色譜法(TLC)檢測標記率,聚酰胺薄層為載體,生理鹽水為展開劑,上行展開。

實驗中的99Tcm-BnAO采用藥盒標記,標記率約為95%。將標記產(chǎn)物于室溫下放置不同時間后,測定放化純度,考察標記物的體外穩(wěn)定性。

2.3 電泳實驗

稱取 0.68 g KH2PO4和 7.16 g Na2HPO4·12H2O溶于 500 mL去離子水中配制0.05 mol/L p H 7的電解液,倒入電解裝置。將99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚分別點樣于紙條中心,將紙條置于電解裝置上,用電解液潤濕,通200 V 恒壓電解30 min。取出紙條,迅速用電吹風吹干,測量標記物的分布。

2.4 脂水分配系數(shù)

在離心管中加入1 mL正辛醇、1 mL生理鹽水和10μL標記產(chǎn)物,于渦旋混合器上劇烈震蕩3 min,使其充分混勻,然后離心5 min。各取10μL上層正辛醇和下層生理鹽水測定計數(shù)。平行3次實驗。

2.5 生物分布

分別隨機選取5只荷S180瘤小鼠,經(jīng)尾靜脈注射0.1 mL(1 MBq)99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚標記液 (放化純度大于90%),分別于注射后 0.5、1、2、4 、8 h 眼眶取血,斷頸處死,取出感興趣區(qū)的組織和器官,用水沖洗,拭干后稱重,計算每克組織器官中的放射性攝取率(%ID/g)。

3 結果與討論

3.1 結構表征

結構鑒定:核磁共振1H NMR(DMSO-d6,400 MHz)δ10.74(s,2H,C=N-OH),4.23(s,4H,NCH2),3.52(m,4H,NCH2OCH2),3.44(m,4H,CH 2OCH 3),3.24(s,6H,CH 2OCH 3),2.22(m,4H,-NHCH 2—),1.86(m,2H,-NHCH 2—),1.30(m,4H,-NHCH 2CH 2—),1.16(s,12H,C(CH 3)2)。高分辨質譜(ESI)C20H43N4O6[M+H]+:m/z理論值為435.317 71,m/z測量值為435.316 73。上述結果表明所合成的產(chǎn)物為目標產(chǎn)物。

3.2 標記率及體外穩(wěn)定性

通過對標記體系中p H、SnCl2用量、反應溫度、中間絡合劑等條件進行優(yōu)化后,所得99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚標記率大于90%。體系中各組分的Rf:99TcmO2·x H2O膠體,99TcmO4-及99Tcm與酒石酸鈉形成的配合物為0～0.3,99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚為0.7～1.0。

標記物于室溫下放置6 h后,放化純度仍大于90%?？梢姌擞洰a(chǎn)物體外穩(wěn)定性良好。通過脂水分配系數(shù)實驗測得99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚的分配系數(shù)為0.187±0.009,99Tcm-BnAO為0.165±0.012,通過修飾后標記物的脂溶性有所提高。

3.3 電泳實驗

99Tcm-BnAO和99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚電泳實驗結果示于圖3和圖4。圖3和圖4顯示,兩個標記物的放射性主要集中在原點,向陽極或陰極遷移非常小。此結果表明,99Tcm-BnAO和99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚為電中性,有利于進行乏氧顯像。

3.4 荷S180瘤小鼠體內(nèi)生物分布

圖3 99 Tcm-BnAO電泳分布圖

99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚在荷S180肉瘤小鼠體內(nèi)的生物分布分別列于表1和表2。對比表2和表1可知,經(jīng)過乙二醇獨甲醚修飾后,標記物水溶性仍很大,在注射30 min后這兩個標記物血液清除都很快。心、肺、胃和肌肉在開始有少量攝取,但很快清除。腦中則幾乎無攝取。隨著時間延長,99Tcm-BnAO及99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚在腫瘤組織的相對攝取量逐漸增加。99Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚的腫瘤與血、腫瘤與肌肉放射性攝取比(T/NT)較99Tcm-BnAO有所降低。

圖4 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚電泳分布圖

表1 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取率(,n=5)

表1 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取率(,n=5)

器官 不同時間的放射性攝取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h血液 1.69±0.32 0.79±0.47 0.55±0.19 0.35±0.17 0.47±0.14心1.54±0.17 0.69±0.23 0.49±0.13 0.34±0.06 0.26±0.02肺2.36±0.11 1.39±0.39 1.21±0.25 0.96±0.19 0.78±0.12肝 10.70±1.01 8.21±1.49 8.02±1.69 7.50±1.34 4.66±0.39脾2.58±0.46 1.63±0.52 1.50±0.25 1.37±0.28 0.93±0.11胃2.18±0.39 1.40±0.49 0.96±0.28 0.91±0.35 0.55±0.04腎4.06±0.68 2.07±0.62 1.83±0.59 1.15±0.18 0.80±0.17肌肉 1.22±0.24 0.49±0.19 0.24±0.06 0.20±0.03 0.14±0.02骨頭 1.04±0.42 0.51±0.18 0.40±0.10 0.30±0.05 0.25±0.06腦0.31±0.03 0.23±0.07 0.15±0.03 0.11±0.02 0.09±0.00腫瘤 1.60±0.35 1.18±0.33 1.03±0.12 0.77±0.27 0.61±0.13小腸 3.66±0.92 4.92±2.18 3.26±1.22 1.69±0.22 0.67±0.04

表2 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取比,n=5)

表2 99 Tcm-BnAO在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取比,n=5)

器官T/NT 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h腫瘤與血液 0.94±0.14 1.67±0.44 2.05±0.66 2.40±1.04 1.35±0.24腫瘤與肌肉 1.36±0.47 2.54±0.53 4.44±1.04 3.94±1.25 4.44±0.92

表3 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)放射性攝取率,n=5)

表3 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)放射性攝取率,n=5)

器官不同時間的放射性攝取率/(%ID·g-1)0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h血液 1.19±0.21 1.12±0.63 0.58±0.11 0.40±0.09 0.23±0.15心0.78±0.02 0.77±0.39 0.35±0.01 0.28±0.02 0.24±0.04肺1.03±0.06 0.97±0.46 0.56±0.06 0.47±0.03 0.40±0.09肝5.13±1.50 5.10±2.50 2.93±0.60 2.61±0.66 1.93±1.01脾0.96±0.06 0.81±0.38 0.55±0.08 0.40±0.04 0.31±0.07胃1.69±0.28 1.53±0.91 1.74±0.79 1.37±0.37 1.04±0.16腎2.61±0.30 2.17±1.04 1.21±0.14 0.99±0.07 0.88±0.25肌肉 0.71±0.09 0.55±0.29 0.24±0.12 0.15±0.01 0.14±0.02骨頭 0.67±0.06 0.58±0.21 0.39±0.09 0.35±0.05 0.28±0.04腦0.11±0.01 0.10±0.03 0.07±0.00 0.05±0.00 0.05±0.01腫瘤 1.03±0.06 0.85±0.37 0.60±0.07 0.41±0.19 0.44±0.04小腸 4.84±0.89 2.48±1.10 1.78±1.03 1.03±0.27 0.66±0.29

表4 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取比(,n=5)

表4 99 Tcm-BnAO-乙二醇獨甲醚在荷S180瘤小鼠體內(nèi)的放射性攝取比(,n=5)

器官T/NT 0.5 h 1 h 2 h 4 h 8 h腫瘤與血液 0.90±0.23 0.80±0.13 1.06±0.28 1.05±0.51 1.27±0.12腫瘤與肌肉 1.47±0.21 1.65±0.40 2.76±0.76 2.71±1.16 3.21±0.24

4 結 論

99Tcm-BnAO作為乏氧顯像劑在臨床上具有一定的腫瘤乏氧診斷的應用價值,但是仍存在一些不足。本工作在配體BnAO的側鏈上進行乙二醇獨甲醚的修飾,希望適當改變脂溶性,但是通過生物分布實驗發(fā)現(xiàn)實際效果并不明顯。因此,要改善99Tcm-BnAO類乏氧顯像劑的性能,還需要大量的研究。

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