鄭璐璐，張貴君，王晶娟，何瑞杰，崔秀梅

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國藥材集團(tuán)公司，北京 101300）

野菊花藥效組分抗炎的生物效應(yīng)研究

鄭璐璐1，張貴君1，王晶娟1，何瑞杰1，崔秀梅2

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.中國藥材集團(tuán)公司，北京 101300）

[目的]驗(yàn)證和進(jìn)一步確定野菊花抗炎的藥效組分，為建立野菊花與臨床療效對應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。[方法]在高效液相色譜（HPLC）分析法確定初步藥效組分基礎(chǔ)上，采用小鼠血管通透性實(shí)驗(yàn)和小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證抗炎的生物效應(yīng),設(shè)立了野菊花水煎劑組、五味消毒飲組、模型組進(jìn)行比較。[結(jié)果]野菊花藥效組分組與模型組相比，有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01），與水煎劑組和五味消毒飲組相比，無顯著性差異（P>0.05）。[結(jié)論]野菊花的藥效組分（綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和蒙花苷）確實(shí)具有抗炎作用，可以作為野菊花抗炎的藥效組分。

野菊花；抗炎藥效組分；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；生物效應(yīng)

野菊花功效清熱解毒，主治癰腫瘡毒、目赤腫痛、眩暈頭痛，是常用的一味中藥，但是由于一直缺少標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（藥效組分）[1]，給野菊花及其制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定帶來了一定的困難。本研究在中藥藥效組分理論的指導(dǎo)下，在由高效液相色譜（HPLC）分析法確定野菊花初步藥效組分基礎(chǔ)上[2-5]，通過現(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)合療效確切的經(jīng)方最終確定了野菊花的抗炎藥效組分，為建立野菊花與臨床相對應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供新的研究思路與方法。

炎癥是臨床常見的一個(gè)病理過程，可以發(fā)生于機(jī)體各部位的組織和器官，炎癥前期主要表現(xiàn)為滲出液增多，后期則以結(jié)締組織增生常見。本研究選用小鼠血管通透性實(shí)驗(yàn)及耳廓腫脹實(shí)驗(yàn)，以地道產(chǎn)區(qū)安徽金寨的野菊花為研究載體，將藥效組分與水煎劑進(jìn)行對比實(shí)驗(yàn)，并通過經(jīng)方和對經(jīng)方的加減對其進(jìn)行同步驗(yàn)證，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 ICR小鼠（18～22）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號：SCX K（京）2006-0009，將其在室溫22～25℃、相對濕度為65%的動(dòng)物室中12h明暗交替照明3～4日，讓其自由進(jìn)食、飲水。

1.2 藥品與儀器 阿司匹林腸溶片：北京太洋藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號060102。0.9%氯化鈉注射液（250mL/瓶）：四川科倫藥業(yè)股份有限公司。伊文思藍(lán)（化學(xué)純、50 g/瓶）：上?；瘜W(xué)試劑公司，批號981016。冰醋酸、二甲苯（500mL/瓶）：北京化工廠。打孔器（直徑8mm），JN-B型精密扭力天平，日立U-3010紫外分析儀。

1.3 溶液配置 野菊花水煎液配置：12 g的安徽金寨野菊花，8倍量水煮2次，混合兩次濾液濃縮得到。五味消毒飲復(fù)方配置：金銀花15 g，野菊花6 g，蒲公英6 g，紫花地丁6 g，天葵6 g，8倍量水煮兩次，混合兩次濾液濃縮得到。五味消毒飲復(fù)方減去野菊花再加上藥效組分溶液的配置，以下簡稱“復(fù)減野加組分”組：金銀花15 g，蒲公英6 g，紫花地丁6 g，天葵6 g，8倍量水煮兩次，混合兩次濾液濃縮，再加入藥效組分（綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、蒙花苷）。藥效組分高劑量組的配置：按金寨產(chǎn)野菊花中各藥效組分所測含量，配制成每mL含綠原酸0.511mg、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷 0.157mg、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷0.146mg、蒙花苷1.179mg的溶液；藥效組分中劑量組是將高劑量組的濃度稀釋1倍；藥效組分低劑量組是將中劑量組的濃度稀釋1倍。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠血管通透性實(shí)驗(yàn)（急性滲出實(shí)驗(yàn)）

2.1.1 分組與給藥 ICR小鼠90只（雌雄各半）隨機(jī)分為9組，每組10只。第1組為空白組(給等量蒸餾水)，第2組為模型組（給等量生理鹽水），第3組為陽性對照組[給阿司匹林溶液0.013 g/（kg·d）]，第4組為野菊花水煎液組[1.56 g/（kg·d）]，第5組為野菊花藥效組分低劑量組（0.4mL/d），第6組為野菊花藥效組分中劑量組（0.4 mL/d），第7組為野菊花藥效組分高劑量組（0.4 mL/d），第8組為五味消毒飲組[5.07 g/（kg·d）]，第9組為“復(fù)減野加組分”組[4.29 g/（kg·d）]，陽性阿司匹林組只在實(shí)驗(yàn)最后一天給藥，其他組每天給藥1次，連續(xù)7 d。

2.1.2 測定指標(biāo) 末次給藥30min后除空白組外，各鼠均尾靜脈注射0.5%伊文斯藍(lán)生理鹽水溶液0.2mL，隨即腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2mL/20 g，20min后脫臼處死，腹腔注射5mL生理鹽水，輕揉小鼠腹部，以使腹腔內(nèi)染料充分溶于生理鹽水中并混合均勻，剪開腹部皮膚肌肉，用吸管吸取腹腔洗出液4mL，3 000 r/min離心15min；取上清液于608 nm處比色測定光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出每只小鼠腹腔滲入的伊文思蘭含量（g/L）[6]，該數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.3 伊文思蘭溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將準(zhǔn)確配制的0.4987%伊文思藍(lán)溶液稀釋成 9.68、7.26、4.84、2.42、1.21mg/L等濃度的溶液，在590 nm處比色測定，根據(jù)OD值與濃度，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.022X+0.0379，r=0.9981。

2.2 小鼠耳緣腫脹實(shí)驗(yàn)（慢性腫脹實(shí)驗(yàn)）

2.2.1 分組與給藥 分組方法和給藥劑量同2.1.1。灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d。

2.2.2 測定指標(biāo) 末次給藥后1 h，除空白組外，在每只小鼠左耳涂二甲苯50μL，右耳為對照，涂二甲苯45min后處死小鼠，沿耳廓線剪下左右耳，用直徑8mm的打孔器將雙耳同部位等面積切下，分別稱質(zhì)量，以左、右耳片質(zhì)量之差為腫脹度，計(jì)算抑制率[6]。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用 SAS8.2統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，正態(tài)分布資料的組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果

3.1 野菊花藥效組分對小鼠血管通透性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白組小鼠的腹腔洗滌液顏色幾乎為透明，腹腔液滲出染料的OD值很小，模型組小鼠的腹腔洗滌液顏色為藍(lán)色，腹腔液滲出染料的OD值較大，且空白組與模型組腹腔液滲出染料的OD值相比，具有顯著性差異（P<0.01），證明造模成功。

各藥物組小鼠的腹腔洗滌液與模型組相比顏色淺，經(jīng)比色測定小鼠腹腔滲出染料量少且具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），則各受試藥物組均可明顯抑制H+所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加。藥效組分的低、中、高劑量組，五味消毒飲復(fù)方組及“復(fù)減野加組分”組，與水煎液組相比均無顯著性差異（P>0.05），則證明野菊花的藥效組分確實(shí)具有急性抗炎作用，其抗炎藥效組分為：綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和蒙花苷。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1。

表1 對HAc所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響（±s,n＝10)Tab.1 Effecton capillary permeability increasing induced by HAC inm ice（±s,n＝10)

表1 對HAc所致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響（±s,n＝10)Tab.1 Effecton capillary permeability increasing induced by HAC inm ice（±s,n＝10)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

伊文思蘭含量（mg/L）空白組 0 0.96×10－2-1.286±0.021 0**模型組 0 16.42×10-2-5.741±0.024 0陽性組 0.013 3.92×10-2-0.059±0.024 0**水煎液組 1.560 13.09×10-2-4.227±0.184 4*藥效組分組 低 0.012 9 8.73×10-2-2.245±0.110 0**中 0.006 5 6.12×10-2-1.059±0.069 0**高 0.003 2 4.71×10-2-0.418±0.009 5**五味消毒飲水煎液 5.070 7.11×10-2-1.509±0.067 0**“復(fù)減野加組分”組 4.290 8.32×10-2-2.059±0.086 0**組別 劑量（g/kg）OD值（x）

3.2 野菊花藥效組分對小鼠耳廓二甲苯致炎的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白組與模型組相比，腫脹度差異顯著（P＜0.01），則證明造模成功。各組受試藥物與模型組相比，均有顯著性差異（P＜0.05或 P＜0.01），則證明各用藥組均可抑制小鼠耳廓腫脹。藥效組分組、五味消毒飲組和“復(fù)減野加組分”組與水煎劑組相比，無顯著性差異（P>0.05），證明藥效組分、復(fù)方組與水煎液組均可抑制二甲苯引起的腫脹，其中藥效組分中劑量組、高劑量組和“復(fù)減野加組分”組的腫脹抑制率較高。見表2。

4 討論

小鼠血管通透性和小鼠耳緣腫脹的動(dòng)物模型是研究抗炎作用的經(jīng)典模型，本實(shí)驗(yàn)中野菊花水煎劑、藥效組分及經(jīng)方五味消毒飲均能顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹，以及醋酸所造成的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高。有研究表明野菊花具有抗菌消炎的作用[7]。本課題組研究得到的藥效組分與水煎劑相比，在抗炎方面均差異不顯著（P>0.05），并在經(jīng)方五味消毒飲中得到驗(yàn)證。即：綠原酸、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷和蒙花苷為野菊花的抗炎藥效組分。

表2 對小鼠耳廓二甲苯致炎的影響（±s,n＝10)Tab.2 Theeffecton xylene-induced inflammation of m iceears（±s,n＝10)

表2 對小鼠耳廓二甲苯致炎的影響（±s,n＝10)Tab.2 Theeffecton xylene-induced inflammation of m iceears（±s,n＝10)

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

抑制率（%）空白組 0 0.3±0.68** -8.3模型組 0 1.2±0.66 -陽性組 0.013 0.4±1.26** 66.67水煎液組 1.56 0.8±0.63** 33.33藥效組分組 低 0.0129 1.0±0.37* 16.67中 0.0065 0.8±0.14* 25高 0.0032 0.6±0.15** 50五味消毒飲水煎液 5.07 0.9±0.19 25“復(fù)減野加組分”組 4.29 0.7±0.20** 41.67組別 劑量（g/kg·d）腫脹度（mg）

本研究同時(shí)設(shè)立了空白組和模型組，以期通過空白和模型的比較證明造模的成功，而且在通過經(jīng)方進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，將復(fù)方中的野菊花藥材換成野菊花藥效組分進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步證明了本實(shí)驗(yàn)室所篩出的野菊花藥效組分確實(shí)與臨床療效有一定相關(guān)性。

[1]張貴君，羅 容，王奕潔.中藥藥效組分理論與中藥組分學(xué)[J].中藥材，2007，30（2）：125-126.

[2]吳明俠，張貴君.HPLC測定野菊花中兩種黃酮類藥效組分的含量[J].中國現(xiàn)代中藥，2008，10（2）：20-22.

[3]吳明俠，張貴君.HPLC測定野菊花70%乙醇提取物中兩種有機(jī)酸類藥效組分的含量[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2007，35（6）：33-35.

[4]吳明俠，張貴君.HPLC測定野菊花水提取液中有機(jī)酸類藥效組分的含量[J].中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2008，2（12）：10－12.

[5]張春暉，張貴君，楊晶凡，等.中藥黃金菊湯劑君藥的6種抗炎藥效組分含量測定[J].中國現(xiàn)代中藥，2009，11（7）：15-17.

[6]徐淑云，卞如濂，陳 修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2003：17-27.

[7]李風(fēng)麗，李 進(jìn)，陳 濤，等.野菊花微型灌腸液提取工藝的研究[J].天津中醫(yī)藥，2007，24（2）：159-160.

Biologicalanti-inflammatory effects in active com ponents of FlosChrysanthem i Indici

ZHENG Lu-lu,ZHANGGui-jun,WANG Jing-juan,etal
（Chinese Herb College,Beijing University of TCM,Beijing100102,China）

[Objective]To verify the active components of anti-inflammatory effectand provide the scientific basis date for the clinical curative effect of quality standards in Flos Chrysanthemi Indici.[Methods]On the basis of determining the active components of the classic prescription by HPLC analysis the biological anti-inflammatory effectswas demonstrated bymice vascular permeability test and auricle tumefaction test.The FlosChrysanthemi Indicidecoction group andWuweiXiaodu decoction groupwereestablished and compared with themodelgroup.[Results]Compared withmodelgroup,Flos Chrysanthemi Indiciactive components group had significant difference(P<0.05 or P<0.01).Therewasno significantdifference between Flos Chrysanthemi Indicidecoction group and the“WuweiXiaodu drinking” group(P>0.05).[Conclusion]The active componentsof Flos Chrysanthemi Indici(Chlorogenic acid,Luteolin-7-O-β-D-glucoside,Apigenin-7-O-β-D-glucoside and Buddleoside)really have obviouseffectsofanti-inflammation,so they are the active componentsof anti-inflammatory effectof Flos Chrysanthemi Indici.

FlosChrysanthemi Indici;active componentsofanti-inflammatory effect;quality standards;biologicaleffects

R284.2

A

1672-1519(2011)03-0251-03

鄭璐璐（1984-），女，碩士研究生，主要研究方向：中藥藥效組分及中藥藥效組分質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。

張貴君。

2010-11-22）