宋蘇沛，王 雷，廖藝聰，劉晶晶，張明陽，周美艷，

周慧軒1，唐 然1，戴體俊3

(徐州醫(yī)學(xué)院1.麻醉學(xué)院，2.研究生學(xué)院，3.江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221002)

研究證實(shí)，腦內(nèi)存在特異性 γ-羥基丁酸(gamma-hydroxybutyrate，GHB)受體，且屬于G蛋白耦聯(lián)受體超級(jí)家族(Go或Gi家族)［1］，并且已在大鼠上克隆了 GHB受體的 cDNA［2］。NCS-382是GHB 受體的特異性拮抗劑［3］，周慧軒等［4］亦證實(shí)，GHB受體是異氟烷催眠作用的靶位，但并非其鎮(zhèn)痛作用的靶位。筆者以往的研究只限于吸入麻醉藥，丙泊酚、氯胺酮和依托咪酯為臨床常用靜脈麻醉藥，起效快、作用強(qiáng)，患者依從性好，且麻醉實(shí)施相對(duì)簡單，對(duì)藥物輸注器材的要求不高［5］，闡明靜脈麻醉藥的全麻原理對(duì)于更好地監(jiān)測麻醉深度、提高臨床麻醉的質(zhì)量、擴(kuò)大全麻藥的用途乃至解釋腦的奧秘都有重大意義［6］。本實(shí)驗(yàn)通過建立丙泊酚、氯胺酮和依托咪酯的催眠模型和氯胺酮的鎮(zhèn)痛模型探討GHB受體與丙泊酚、氯胺酮和依托咪酯催眠作用的關(guān)系以及其與氯胺酮鎮(zhèn)痛作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

丙泊酚注射液(意大利AstraZeneca S.p.A公司，批號(hào):GP256)，鹽酸氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)KH071001)，依托咪酯脂肪乳注射液(江蘇恩華藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):20090606)，NCS-382(美國 Sigma 公司，批號(hào):066K47041)，0.9%氯化鈉注射液(石家莊四藥有限公司，批號(hào):100517603)，人工腦脊液(aCSF)根據(jù)文獻(xiàn)［7］配制，pH=7.4，icv 容積為 5 μl。微量進(jìn)樣器(上海醫(yī)用激光儀器廠)，HH-42型快速恒溫水浴箱(常州國華電器有限公司)。

1.2 動(dòng)物

昆明種小鼠，清潔級(jí)，動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(蘇)2002-0022，體質(zhì)量18～23 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。受試小鼠在實(shí)驗(yàn)前2 d熟悉實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，自由攝食飲水，按分層隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，使各組動(dòng)物體質(zhì)量和性別比例相似。為避免小鼠各時(shí)間段可能出現(xiàn)行為差異對(duì)研究結(jié)果的影響，實(shí)驗(yàn)于每日同一時(shí)間段進(jìn)行。丙泊酚和依托咪酯注射容積為20 ml·kg－1，aCSF 注射容積為5 μl，生理鹽水和氯胺酮注射容積為 10 ml·kg－1。

1.3 催醒實(shí)驗(yàn)

120只昆明種小鼠，♀♂各半。分為3大組，分別ip 給予丙泊酚200 mg·kg－1、氯胺酮 150 mg·kg－1和依托咪酯40 mg·kg－1，待翻正反射消失后1 min，每大組再分為4亞組，分別 icv［8］給予 aCSF 及 NCS-382 1，5和25 μg·kg－1，容積均為 5 μl，注射時(shí)間為 5 s，留針25 s。記錄各組小鼠從翻正反射消失到翻正反射恢復(fù)的時(shí)間，即睡眠時(shí)間(sleeping time，ST)。

1.4 熱板法實(shí)驗(yàn)［8］測定痛閾

小鼠置于恒溫水浴箱(55±0.5)℃，記錄其從足部接觸熱板到開始舔后足的時(shí)間為熱板法痛閾(pain threshold in hot-plate test，HPPT)，給藥前每只小鼠首先測HPPT 2次，間隔5 min，取其平均值作為基礎(chǔ)痛閾，剔除基礎(chǔ)痛閾＞30 s或＜5 s的動(dòng)物。給藥后，為了避免足部燙傷，限定停留時(shí)間不超過60 s，超過60 s者，其 HPPT 記為60 s。

80只昆明小鼠，分為2大組:正常對(duì)照組ip給予生理鹽水和鎮(zhèn)痛模型組ip給予氯胺酮40 mg·kg－1，5 min后，按照各亞組分別ith［8］給予aCSF和NCS-382 1，5 和25 μg·kg－1，容積均為 5 μl，注射時(shí)間為5 s，留針15 s。分別記錄10，20，30和40 min的HPPT。

1.5 扭體實(shí)驗(yàn)［8］測定扭體次數(shù)

80只昆明小鼠，分為8亞組，每組10只。分組處理同熱板法實(shí)驗(yàn)。ith處理后1 min，ip給予1.0%冰醋酸溶液10 ml·kg－1致痛(可致其出現(xiàn)腹部內(nèi)凹、軀干與后肢伸張、臀部高抬等行為反應(yīng))，立即記錄注射冰醋酸后15 min內(nèi)小鼠扭體次數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 NCS-382對(duì)丙泊酚、氯胺酮和依托咪酯催眠小鼠睡眠時(shí)間的影響

ip給予丙泊酚、氯胺酮、依托咪酯后均能使小鼠翻正反射消失。小鼠icv給予NCS-382 1，5和25 mg·kg－1后，均逐漸恢復(fù)翻正反射，睡眠時(shí)間明顯縮短(P ＜0.05)。

表1 NCS-382對(duì)丙泊酚、氯胺酮和依托咪酯催眠小鼠睡眠時(shí)間的影響Tab.1 Effect of NCS-382 on sleeping time of mice anesthetized by propofol，ketamine and etomidate

2.2 NCS-382對(duì)鎮(zhèn)痛作用的影響

2.2.1 NCS-382 對(duì)痛閾的影響

表2結(jié)果顯示，NCS-382 1，5 和 25 mg·kg－1對(duì)其HPPT無影響。與自身基礎(chǔ)痛閾比較，小鼠ip給予氯胺酮 40 mg·kg－1鎮(zhèn)痛 10，20和 30 min后，HPPT延長(P＜0.05)，但40 min后HPPT的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。氯胺酮鎮(zhèn)痛小鼠給予NCS-382 1，5和25 μg·kg－110和 20 min后，HPPT較自身基礎(chǔ)HPPT也明顯延長(P＜0.05)，30 min后只有 NCS-382 25 μg·kg－1組 HPPT 明顯延長(P ＜0.05)。與同一時(shí)間點(diǎn)的氯胺酮組相比，NCS-382 1，5和25 μg·kg－1對(duì)HPPT無顯著差異，說明 NCS-382對(duì)氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用無改善作用。

2.2.2 NCS-382 對(duì)扭體次數(shù)的影響

表3結(jié)果顯示，正常小鼠注射NCS-382 1，5和25 μg·kg－1對(duì)扭體次數(shù)無明顯影響;與正常對(duì)照組小鼠相比，氯胺酮40 mg·kg－1使小鼠扭體次數(shù)明顯減少至29±8次(P＜0.05);5 min后給予NCS-382 1，5和25 μg·kg－1對(duì)氯胺酮鎮(zhèn)痛導(dǎo)致的小鼠扭體次數(shù)減少無改善作用，依舊明顯低于正常對(duì)照組小鼠(P＜0.05)。

表2 NCS-382對(duì)氯胺酮鎮(zhèn)痛小鼠痛閾(HPPT)的影響Tab.2 Effect of NCS-382 on pain threshold in hot-plate test(HPPT)analgesia by ketamine in mice

表3 NCS-382對(duì)氯胺酮鎮(zhèn)痛小鼠扭體次數(shù)的影響Tab.3 Effect of NCS-382 on writhing test analgesia by ketamine in mice

3 討論

本實(shí)驗(yàn)表明，GHB受體拮抗劑NCS-382可以減少丙泊酚、氯胺酮和依托咪酯麻醉小鼠的睡眠時(shí)間，但是對(duì)氯胺酮鎮(zhèn)痛小鼠的HPPT和扭體次數(shù)無明顯影響。

麻醉藥的催眠作用主要與大腦的活動(dòng)有關(guān)，而鎮(zhèn)痛作用主要由脊髓所介導(dǎo)［9］，因此，在催眠實(shí)驗(yàn)中，采用icv給藥，而在鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)中采用ith給藥的方法，使藥物直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同部位，可避免或最大限度地排除經(jīng)iv或ip給藥對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的其他系統(tǒng)的影響，使觀察結(jié)果更為可靠［10］。

翻正反射反映高級(jí)中樞的整合功能，是動(dòng)物從麻醉狀態(tài)恢復(fù)清醒的重要指標(biāo)。Koek等［11］認(rèn)為GHB可調(diào)控特異表達(dá)GABAB受體通路中部分GABA的合成和釋放。而GHB的代謝產(chǎn)物γ-丁內(nèi)酯具有有限的GABA受體激動(dòng)劑活性［12］。另有研究發(fā)現(xiàn)，GHB可以抑制多巴胺神經(jīng)元的興奮性［13］，同時(shí)可以調(diào)節(jié)5-羥色胺和乙酰膽堿的攝取與釋放以及鈣通道通透性及cGMP的釋放［3，14］。在催醒實(shí)驗(yàn)中，丙泊酚、氯胺酮和依托咪酯可能部分通過GHB受體的介導(dǎo)產(chǎn)生了催眠作用。但NCS-382的催醒作用并不能像納洛酮拮抗阿片類或氟馬西尼催醒苯二氮艸

卓類那樣，起到立竿見影的效果，只縮短一半左右的睡眠時(shí)間，提示靜脈麻醉藥引起的催眠機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，還涉及其他作用機(jī)制。

熱板和扭體實(shí)驗(yàn)是進(jìn)行疼痛研究的常用方法。氯胺酮與μ阿片受體和N-甲基-D-天冬氨酸受體的相互作用介導(dǎo)其某些鎮(zhèn)痛作用，氯胺酮對(duì)脊髓的鎮(zhèn)痛作用可能是對(duì)背角神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)力范圍神經(jīng)活動(dòng)抑制作用的結(jié)果［15］。而GHB受體在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及外周組織并不表達(dá)，它專一表達(dá)于包括額葉皮質(zhì)在內(nèi)的整個(gè)大腦皮質(zhì)、海馬、紋狀體、嗅束、丘腦、A9、A10、A12 等多巴胺能神經(jīng)核團(tuán)［16］。氯胺酮組在熱板法和扭體法均表現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛作用，而ith給予NCS-382對(duì)氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用無明顯影響，提示氯胺酮的鎮(zhèn)痛作用機(jī)制與GHB受體關(guān)系不大。

全身麻醉包括鎮(zhèn)痛、催眠、意識(shí)消失、認(rèn)知障礙、肌肉松弛、抑制異常應(yīng)激反應(yīng)等方面，而催眠、鎮(zhèn)痛作用是其最基本、最重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，GHB受體可能介導(dǎo)了丙泊酚、氯胺酮和依托咪酯催眠的作用，但與氯胺酮熱、化學(xué)刺激的鎮(zhèn)痛作用關(guān)系不大。這提示靜脈麻醉藥可能存在共同的催眠作用受體，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入的研究。

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