周錢(qián)梅，蘇式兵

(上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)復(fù)雜系統(tǒng)研究中心，上海 201203)

姜黃素(curcumin)是以傳統(tǒng)中藥材姜黃為原料，提取精制而得的食用天然黃色素。它被報(bào)道具有腫瘤細(xì)胞增殖抑制［1］等抗腫瘤作用，并對(duì)順鉑的化療毒性作用有一定的防護(hù)效果［2］。研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過(guò)抑制糖調(diào)節(jié)蛋白P58介導(dǎo)的絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)與DNA的交聯(lián)，減少M(fèi)MC抗腫瘤的毒性作用［3］，MMC是一種細(xì)胞周期非特異性廣譜抗瘤藥物，可使細(xì)胞的DNA解聚，同時(shí)阻礙DNA的復(fù)制，從而抑制癌細(xì)胞分裂［4］。由于MMC抗癌治療易引起耐藥性，且伴隨著諸如腎功能損害、骨髓抑制等毒副作用［5］，只能作為乳腺癌治療的三線(xiàn)化療藥物?；瘜W(xué)預(yù)防治療是指應(yīng)用相對(duì)無(wú)毒的天然或合成的藥物干預(yù)癌癥發(fā)生、發(fā)展的各個(gè)階段，能降低癌癥的危險(xiǎn)性，且已呈現(xiàn)出良好的發(fā)展前景［6］。姜黃素是一種相對(duì)低毒的植物衍生的多酚類(lèi)化合物，具有潛在化學(xué)預(yù)防作用。已有研究報(bào)道，姜黃素與順鉑聯(lián)合應(yīng)用后使一些腫瘤相關(guān)的酶趨于正?；淇勺鳛轫樸K化療藥物很好的輔助治療藥物［7］。但對(duì)其如何減少M(fèi)MC抗腫瘤腎毒性的機(jī)制缺乏研究。本研究將姜黃素和不同濃度MMC聯(lián)合用藥與單獨(dú)使用MMC比較，觀察腫瘤生長(zhǎng)被抑制狀態(tài)下，移植瘤鼠腎功能損傷狀況，并檢測(cè)MMC在腎的分布，探討姜黃素改善MMC所致腎功能損傷及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

姜黃素購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。MMC購(gòu)自美國(guó)ICN公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)PAA公司。牛胰島素購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。二甲亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，血肌酐(creatinine，Cre)和血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。Survyor型液相色譜儀及LCQ DECA XPplus質(zhì)譜儀購(gòu)自美國(guó)Finnigan公司。SEVAP系列氮吹儀購(gòu)自美國(guó)Organomation公司。Synergy2酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及乳腺癌異種移植瘤裸鼠模型的制備

MCF-7細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院健康所荊清課題組惠贈(zèng)。MCF-7細(xì)胞種植在RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%FBS，胰島素 0.01 g·L－1，青鏈霉素 100 kU·L－1混合液，HEPES 20 mmol·L－1)中，細(xì)胞在 37℃ 5%CO2環(huán)境中單層生長(zhǎng)。

將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞1×1010L－1接種于雌性裸鼠的乳房頰脂墊。在接種細(xì)胞前24 h，裸鼠ip給予苯甲酸雌二醇5 g·kg－1，每隔5 d補(bǔ)加1次，共14 d。

1.3 動(dòng)物分組與給藥

以DMSO溶解姜黃素粉末，配制成40 mmol·L－1溶液(儲(chǔ)存液)，置 4℃ 冰箱保存，臨用時(shí)稀釋成所需濃度(DMSO終濃度＜0.1%)。MMC以生理鹽水溶解，配制成1 mmol·L－1溶液(儲(chǔ)存液)，置4℃避光保存。

BALB/c裸鼠72只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005，7周齡，雌性，體質(zhì)量19～23 g，上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。在造模2周后，除正常對(duì)照組外，移植瘤裸鼠被隨機(jī)分為模型組;姜黃素100 mg·kg－1組，ip 給予 0.2 ml，隔天給藥 1 次;MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1組，每隔 5 d 給藥 1 次;姜黃素 +MMC組，同時(shí)給予兩藥，給藥頻率同各單獨(dú)用藥頻率。給藥4周后眼眶取血，800×g離心3 min分離血清備Cre和BUN檢測(cè)。取血后即刻行頸脫位法處死小鼠，解剖后取瘤塊，稱(chēng)其質(zhì)量，取腎組織檢測(cè)藥物分布量。

1.4 觀察動(dòng)物體質(zhì)量及存活情況

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按其體質(zhì)量隨機(jī)分組，分別于造模前、給藥前及給藥結(jié)束后稱(chēng)體質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)僅比較給藥結(jié)束后各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)整個(gè)過(guò)程中記錄各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡數(shù)目，計(jì)算各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的存活率。

1.5 測(cè)定腫瘤質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥4周，頸脫位法處死小鼠后，在接種乳腺癌細(xì)胞MCF-7處原位解剖取瘤塊稱(chēng)重。

1.6 檢測(cè)血清肌酐

取血清0.1 ml加入鎢酸蛋白沉淀劑1 ml，充分混勻，800×g離心10 min，取上清按Cre檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定吸光度(absorance，A)并按以下公式計(jì)算血清 Cre含量:血清 Cre(μmol·L－1)=(A測(cè)定管－A空白管)/(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)× 標(biāo)準(zhǔn)管濃度(10 μmol·L－1)×11。

1.7 檢測(cè)血清尿素氮

取血清 0.05 ml加入2.5 ml肟溶液1 g·L－1、酸溶液2.5 ml，混勻，置沸水中15 min，立即用自來(lái)水冷卻。使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，測(cè)定A值后，按以下公式計(jì)算血清 BUN含量:BUN(mmol·L－1)=(A測(cè)定管－A空白管)/(A標(biāo)準(zhǔn)管－A空白管)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(10 mmol·L－1)×樣本測(cè)試前的稀釋倍數(shù)。

1.8 液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)腫瘤組織中的藥物分布

姜黃素和MMC的質(zhì)譜條件:Survyor型液相色譜儀及LCQ DECA XPplus質(zhì)譜儀配有ESI離子化源和離子阱質(zhì)量分析器，Xcalibur1.3 workstation數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。色譜柱:Agilent Zorbax Extend-18栓(2.1 mm×150 mm，5 μm);流動(dòng)相:色譜甲醇和超純水;流速:0.3 ml·min－1;柱 溫:30℃;進(jìn) 樣 量:2 μl(MMC:5 μl)。上機(jī)實(shí)驗(yàn)條件，ESI界面:陽(yáng)離子模式;毛細(xì)管溫度:姜黃素270℃，MMC 310℃;噴霧電壓:姜黃素5 kV，MMC 4 kV;毛細(xì)管電壓:姜黃素26 V，MMC 7 V;鞘氣流(N2):姜黃素10 AU，MMC 32 AU;輔助氣流(N2):姜黃素0 AU，MMC 15 AU。表1為時(shí)間-流動(dòng)相組成梯度。

表1 液質(zhì)聯(lián)用儀檢測(cè)姜黃素與絲裂霉素C(MMC)的流動(dòng)相梯度Tab.1 Chromatographic gradient for analysis of curcumin and mitomycin C(MMC)

1.9 色譜法檢測(cè)腎組織絲裂霉素原型藥物分布

取0.2 g腎組織，生理鹽水勻漿后，2200×g離心10 min后取全部上清，加入5倍體積的甲醇，2200×g離心10 min，取全部上清，氮吹儀將其吹干濃縮，再在40℃水浴上以 50% 甲醇-水溶劑溶解成 200 μl，20 000×g離心15 min，取上清，用于色譜檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

等效線(xiàn)圖解法分析藥物聯(lián)合應(yīng)用的效應(yīng)。用公式q=E(AB)/［EA+(1 －EA)×EB］［4］計(jì)算 q值，判定兩藥合用是否增效。其中，E(AB)為兩藥合用的抑制率，EA和EB為兩藥單用的抑制率，q=0.85～1.15表示兩藥作用相加，q＞1.15表示兩藥作用協(xié)同，q＜0.85表示兩藥相互拮抗。

2 結(jié)果

2.1 姜黃素與絲裂霉素聯(lián)合對(duì)動(dòng)物體質(zhì)量及存活率的影響

小鼠給予 MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1出現(xiàn)食欲缺乏和體質(zhì)量減輕。MMC 2 mg·kg－1組體質(zhì)量較模型對(duì)照組減輕了38%(表2)。姜黃素100 mg·kg－1+MMC 1，1.5 和 2 mg·kg－1聯(lián)合用藥組的小鼠食欲正常，與單獨(dú)給與 MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1組比較，體質(zhì)量分別增加了12%，24%和18%(P＜0.05)，與正常對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(表2)。MMC 2 mg·kg－1組存活率為 4/8，MMC 1.5 mg·kg－1組存活率為7/8，而姜黃素 100 mg·kg－1+MMC 1，1.5 和 2 mg·kg－1聯(lián)合用藥組則無(wú)死亡，存活率均為8/8。

表2 姜黃素與MMC聯(lián)合對(duì)BALB/c裸鼠體質(zhì)量的影響Tab.2 Effect of curcumin combined with MMC on body mass of BALB/c nude mice

2.2 姜黃素與絲裂霉素聯(lián)合對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響

如表3所示，與模型對(duì)照組比較，MMC 1 mg·kg－1對(duì)腫瘤大小無(wú)明顯影響;單獨(dú)給予姜黃素或MMC 1.5 和2 mg·kg－1后腫瘤質(zhì)量比模型組分別減少了44.2%，64.5%及 84.5%;姜黃素聯(lián)合 MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1組的腫瘤質(zhì)量分別減少了 40.9%，86.5%和82.7%，均有顯著性差異(P ＜0.05)。其中，姜黃素 +MMC 1.5 mg·kg－1顯著抑制裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，表現(xiàn)為協(xié)同抑瘤作用(q=1.17)。

2.3 姜黃素與MMC聯(lián)合對(duì)小鼠腎功能的影響

表4結(jié)果顯示，與模型組比較，MMC 1，1.5和2mg·kg－1血清中 Cre水平分別升高了14%，27%和82%，BUN水平分別升高了37%，52%和54%，差異顯著(P＜0.05)，表明MMC對(duì)腎功能有損傷作用。分別與相應(yīng)單用MMC組比較，姜黃素+MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1聯(lián)合用藥后，Cre 水平分別降低了19%，25%和43%，BUN水平分別降低了37%，41%和34%，差異顯著(P＜0.05)。提示姜黃素與MMC聯(lián)合用藥后改善了MMC所致的腎功能損傷。

表3 姜黃素與MMC對(duì)BALB/c裸鼠腫瘤質(zhì)量的影響Tab.3 Effect of curcumin combined with MMC on tumor mass of BALB/c nude mice

表4 姜黃素與MMC聯(lián)合對(duì)BALB/c裸鼠血清肌酐(Cre)及血清尿素氮(BUN)的影響Tab.4 Effect of curcumin combined with MMC on levels of serum creatinine(Cre)and blood urea nitrogen(BUN)in BALB/c nude mice

2.4 姜黃素對(duì)絲裂霉素腎分布量的影響

姜黃素與MMC的檢測(cè)均采用選擇離子模式。姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為8.57 min，在質(zhì)荷比為367.3出現(xiàn)分子離子峰。MMC標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為11.10 min，在質(zhì)荷比為357.3出現(xiàn)分子離子峰。

在姜黃素與不同劑量MMC聯(lián)合用藥組小鼠腎組織中均檢測(cè)到姜黃素和MMC原型藥物(表5)。其中，單獨(dú)用MMC 1，1.5 和2 mg·kg－1組中MMC 原型藥物的分布量分別為(11.2 ±5.5，19.9 ±5.2 和33.5 ± 3.9)g·g－1，而姜黃素 +MMC 1，1.5 和 2 mg·kg－1組中MMC原型藥物的分布量分別為(0.99±0.53，2.34 ±1.73 和 5.2 ±1.05)g·g－1。與相應(yīng)的單藥組比較，姜黃素與MMC聯(lián)合用藥后，腎組織中MMC的分布量分別減少了91%(P＜0.01)，88%(P ＜0.01)和84%(P ＜0.01)，提示 MMC 與姜黃素聯(lián)合用藥后，MMC的腎分布量減少。

表5 姜黃素對(duì)MMC在BALB/c裸鼠腎分布量的影響Tab.5 Effect of curcumin on MMC distribution in BALB/c nude kidneys of mice

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MMC 2 mg·kg－1抑制了MCF-7細(xì)胞異種移植瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)，然而其也表現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致死的毒性，該組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡一半，且余下的一半的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也表現(xiàn)出了明顯的毒性作用，如食欲缺乏，體質(zhì)量減輕，出現(xiàn)了明顯的腎功能損傷。姜黃素 100 mg·kg－1與 MMC 1.5 mg·kg－1聯(lián)合用藥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部存活，且降低了MMC的用藥劑量，逆轉(zhuǎn)了MMC引起的腎功能損傷，提高了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生存率和生存質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，MMC單獨(dú)處理 MCF-7 細(xì)胞的 IC50濃度為 5 μmol·L－1，將其與IC50濃度的姜黃素聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其IC50濃度降至1.5 μmol·L－1。可見(jiàn)，姜黃素與 MMC 聯(lián)合用藥后MMC達(dá)到相同的半數(shù)抑制效應(yīng)的濃度顯著降低，我們將進(jìn)一步探討姜黃素與MMC聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腎原代細(xì)胞生長(zhǎng)的影響與毒性。

腎代謝藥物的能力不僅與藥物消除速度有關(guān)，而且與藥物或毒物腎內(nèi)濃度有關(guān)［8］。化療藥物在靶器官的濃聚，會(huì)增加其對(duì)靶器官的損傷，造成不良反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素與不同劑量MMC聯(lián)合用藥在減輕腎功能損傷的同時(shí)，腎組織中檢測(cè)到的MMC的含量明顯低于MMC組，提示姜黃素能顯著降低MMC腎中的分布水平，這可能是姜黃素改善MMC腎毒性的原因之一。

本研究表明，姜黃素可以減少M(fèi)MC抑制腫瘤的用藥量，并能夠通過(guò)減少M(fèi)MC在腎的分布，降低腎毒性，為中西藥結(jié)合治療腫瘤的增效減毒研究提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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