張曉菲，劉麗宏，丁春雷，楊潤(rùn)濤，趙長(zhǎng)琦

(1.北京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100875;2.中國(guó)人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥劑科，北京 100088)

殼聚糖，(1，4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，是甲殼素經(jīng)脫乙?；幚淼漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性和生物降解性，無(wú)毒，物理和化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，目前大量文獻(xiàn)報(bào)道殼聚糖作為藥物緩釋載體，并且具有降血脂、降膽固醇、增強(qiáng)抵抗力等多種生理功效，但殼聚糖溶解性能很差，殼低聚糖是相對(duì)分子量＜10 000的殼聚糖，其溶解性能較殼聚糖大大改觀(guān)，可完全水溶，利于人體的吸收，從而更加發(fā)揮其獨(dú)特的生理活性和物化性質(zhì)，如水溶性、保濕性、抗菌性、抗腫瘤和免疫促進(jìn)性等［1］，使殼聚糖的應(yīng)用范圍大大加寬，在醫(yī)藥上的應(yīng)用發(fā)展迅速。目前國(guó)內(nèi)外大多數(shù)研究都集中在殼聚糖的功能開(kāi)發(fā)和應(yīng)用方面，如藥物緩釋載體、抗凝血、抗菌、降脂和抗氧化［2－3］，但是對(duì)殼聚糖特別是水溶性殼低聚糖在體內(nèi)的代謝吸收等過(guò)程研究較少，而藥代動(dòng)力學(xué)是其發(fā)揮藥理作用的基礎(chǔ)。殼聚糖藥物代謝的研究已成為迫切需要。

熒光標(biāo)記是利用化學(xué)修飾的方法將熒光分子連接到多糖分子上，起到示蹤作用。常用的熒光素為異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)。有研究表明，F(xiàn)ITC標(biāo)記殼聚糖方便、快捷、標(biāo)記率高、方法簡(jiǎn)單，F(xiàn)ITC對(duì)殼聚糖的體內(nèi)代謝幾乎沒(méi)有影響，并且具有準(zhǔn)確，靈敏，安全，為非放射性標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)［4－6］。

本研究中水溶性印跡戊二醛交聯(lián)羧甲基殼低聚糖，簡(jiǎn)稱(chēng)印跡殼低聚糖(imprinted chitooligosaccharides，CTS)，脫乙酰度為95%，平均相對(duì)分子質(zhì)量為2460，合成中采用離子印跡技術(shù)［7－8］并增加了一定的功能基團(tuán)提高其對(duì)有害重金屬離子的特異性高效螯合［9］，明確其代謝和體內(nèi)組織分布特點(diǎn)，將有助于判斷此殼聚糖是否可作為體內(nèi)促排藥物，體內(nèi)螯合有害重金屬后通過(guò)尿液和糞便排出體外，以用于體內(nèi)重金屬中毒的治療。采用熒光示蹤法FITC標(biāo)記CTS(FITC-CTS)，尾靜脈注射后檢測(cè)FITC-CTS在小鼠體內(nèi)組織分布、代謝及降解情況，為研究CTS的藥代動(dòng)力學(xué)和體內(nèi)發(fā)揮生物活性提供理論依據(jù)，從而有助于指導(dǎo)CTS作為促排劑的研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-6AD高效液相色譜，SPD-10AV紫外檢測(cè)器和RF-20AXL熒光檢測(cè)器，日本Shimadzu公司產(chǎn)品;凝膠排阻色譜柱TSK-gel G2000SW(7.5 mm ×30 cm)，日本Tosoh公司產(chǎn)品;Tecan Safire2型全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司產(chǎn)品;微量電動(dòng)組織勻漿器，美國(guó)Kimble公司產(chǎn)品。Sephadex G-25，右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品(相對(duì)分子質(zhì)量分別為 180，4600，7100，21400，41100，84 400，133 800)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;溶菌酶購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司;HCl，NaOH，NaH2PO4，Na2HPO4和NaCl購(gòu)自北京化學(xué)試劑有限公司。

1.2 CTS及FITC標(biāo)記

CTS由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物毒物研究所合成提供。原料殼聚糖為黏均相對(duì)分子質(zhì)量1.65×105，脫乙酰度95%，經(jīng)Cu2+印跡、戊二醛交聯(lián)、脫印跡模板、羧甲基化以及氫化等修飾后H2O2氧化形成低聚水溶性印跡CTS(圖1)，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱，收集分子量最高的幾個(gè)組分，并制成凍干粉，得到分子量相對(duì)均一的殼低聚糖衍生物。

圖1 印跡殼低聚糖(CTS)結(jié)構(gòu).○代表印跡后留下的“孔穴”.Fig.1 Structure of the imprinted chitooligosaccharide(CTS).

CTS的氨基與FITC連接(圖2)，使 CTS具有FITC的熒光特性。樣品CTS(脫乙酰度為95%)300 mg溶于10 ml水，加入21 mg FTIC，室溫下攪拌72 h，濾紙過(guò)濾后加入Sephadex G-25柱 (2.8 cm×30 cm)，洗脫液為 1/15 mol·L－1PBS(含 NaCl 0.2 mol·L－1，pH 5.5)，餾分通過(guò)高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量分布，收集相對(duì)分子質(zhì)量最高的幾個(gè)餾分，透析袋(截流相對(duì)分子質(zhì)量1000)內(nèi)透析除鹽后制成FITC-CTS凍干粉。

圖2 異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的CTS.羧甲基化后的殼低聚糖，a，b位分別可部分被羧甲基化.Fig.2 Fluorescein isothiocyanate(FITC)labeled CTS.

1.3 高效凝膠滲透色譜法測(cè)定CTS相對(duì)分子質(zhì)量

采用HPGDC色譜法，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm，流動(dòng)相 PBS 0.1 mol·L－1，流速 0.5 ml·min－1。右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)品及CTS樣品溶于流動(dòng)相，0.45 nm微孔過(guò)濾器過(guò)濾并經(jīng)超聲脫氣，進(jìn)樣量10 μl，上述條件下得到分子量標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)CTS樣品的典型色譜圖，記錄洗脫峰的保留時(shí)間。GPC軟件計(jì)算樣品平均相對(duì)分子質(zhì)量。

1.4 熒光分光光度法測(cè)定CTS含量

FITC熒光采用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)520 nm。FITC標(biāo)記量測(cè)定:全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定FITC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和FITC-CTS的熒光強(qiáng)度，根據(jù)FITC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得到FITC濃度－熒光強(qiáng)度公式，測(cè)定FITC-CTS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的熒光強(qiáng)度，計(jì)算FITC-CTS的FITC標(biāo)記率(每克FITC-CTS中FITC含量)。

FITC-CTS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn):FITC-CTS溶于生理鹽水，配制成5 g·L－1的溶液，用生理鹽水逐步稀釋?zhuān)纬蓾舛确謩e為 0，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10 g·L－1的FITC-CTS標(biāo)準(zhǔn)液。取FITC-CTS標(biāo)準(zhǔn)液，加入3倍體積 HCl 1 mol·L－1，混勻后取0.5 ml，加入 NaOH 1 mol·L－1(0.37 ml)，0.2 mol·L－1PBS pH 6.15(1.13 ml)，混勻，Tecan Safire2 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度 A為縱坐標(biāo)，F(xiàn)ITC-CTS濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，建立回歸方程，c(g·L－1)=8138.6(Ai－ A0)+1.1579，Ai為樣品熒光強(qiáng)度，A0為空白熒光強(qiáng)度;R2=0.9986。

1.5 CTS及FITC-CTS穩(wěn)定性的測(cè)定

將 CTS 及 FITC-CTS 2.75 g·L－1溶于 0.1 mol·L－1PBS 中， 加 入 或 不 加 入 溶 菌 酶 (19 mg·L－1)，37℃恒溫水浴，烏氏黏度計(jì)測(cè)定48 h內(nèi)殼低聚糖相對(duì)黏度變化，并用HPGPC法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量變化。

1.6 動(dòng)物分組給藥

雄性昆明小鼠49只，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(京)2006-0025。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水，小鼠尾靜脈iv給予 FITC-CTS 100 mg·kg－1后，于10 min，0.5，1，4，12，24和48 h收集尿液，摘眼球取血0.5 ml置于肝素抗凝離心管中，頸椎脫臼處死后立即解剖取心、肝、脾、肺、腎和股骨，－20℃保存。

1.7 生物樣品預(yù)處理

各取等重量或體積的小鼠肝、腎、脾、肺、股骨、血液、尿液、糞樣品，加入等量生理鹽水，除血液和尿液外，電動(dòng)勻漿器制成勻漿后加入3倍體積的HCl 1 mol·L－1，混勻，800 ×g 離心5 min，取上清液備用，血液離心取上清，加入3倍體積 HCl 1 mol·L－1，混勻，800×g離心5 min，取上清液備用。備用液0.5 ml，加入 0.37 ml NaOH 1 mol·L－1，PBS 0.2 mol·L－1，pH 6.15(1.13 ml)，混勻，Tecan Safire2 全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀測(cè)定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)495 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 520 nm)，尿液用 PBS 0.2 mol·L－1pH 6.15 適當(dāng)稀釋后直接用酶標(biāo)儀測(cè)定。小鼠組織及尿液、血液、糞樣品加入 FITC-CTS 0.625，1.25 和 2.5 g·L－1溶 液，計(jì) 算 各 組 織 中FITC-CTS的回收率。根據(jù)FITC-CTS標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和回收率，計(jì)算各組織中FITC-CTS濃度和分布量，以及FITC-CTS通過(guò)尿液排除量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GPC軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并進(jìn)行線(xiàn)性回歸，計(jì)算樣品分子量;采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 CTS的相對(duì)分子質(zhì)量，F(xiàn)ITC標(biāo)記率及溶菌酶中的穩(wěn)定性

根據(jù)右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)品由GPC專(zhuān)用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，以右旋糖苷標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量180，4600，7100，21 400，41 100，84 400，133 800 的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，以相應(yīng)色譜峰的保留時(shí)間為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程:logMr=13.900 － 0.172t，R2=0.9977，根據(jù) CTS樣品保留時(shí)間(圖 3)，計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在1000～20 000，平均相對(duì)分子質(zhì)量2460。

圖3 高效凝膠滲透色譜法測(cè)定CTS相對(duì)分子質(zhì)量.Fig.3 Relative molecular mass of CTS detected by high performance gel permeation chromatogram.

利用Sephadex G-25凝膠柱可將FITC-CTS(相對(duì)分子質(zhì)量1000～20 000)與未標(biāo)記上的FITC(相對(duì)分子質(zhì)量384)和少部分小分子量CTS分離，得到分子量相對(duì)大的均一的5 ml FITC-CTS餾分。收集的餾分通過(guò)HPGPC法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍(圖4)，餾分6，9，12，15，28的洗脫峰保留時(shí)間依次延長(zhǎng)，標(biāo)準(zhǔn)品FITC出峰時(shí)間最長(zhǎng)，餾分中明顯將FITC和小分子量FITC-CTS分離，收集目標(biāo)分子量FITC-CTS的餾分，透析后制備凍干粉，得到純化的分子量相對(duì)均一的FITC-CTS，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，然后比對(duì)FITC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的熒光強(qiáng)度，計(jì)算FITC-CTS中FITC標(biāo)記率3.8%(每100 g FITC-CTS中 FITC的含量)。

圖4 HPGPC色譜測(cè)定FITC-CTS混懸液經(jīng)Sephadex G25柱后不同餾分相對(duì)分子質(zhì)量范圍.A～F:FITC和餾分6，9，12，15，28.Fig.4 Relative molecular mass range of fractions of FITCCTS solution through Sephadex G25 column by HPGPC.

CTS及FITC-CTS加入或不加入溶菌酶，烏氏黏度計(jì)測(cè)定48 h內(nèi)相對(duì)黏度都沒(méi)有任何變化，HPGPC法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量也都無(wú)變化，認(rèn)為 CTS和FITC-CTS不易被溶菌酶降解(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2 FITC-CTS在小鼠體內(nèi)的代謝降解

FITC-CTS在小鼠體內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)尿樣的HPGPC圖譜(圖5)，比對(duì)相同條件下FITC-CTS原料的圖譜，12 h點(diǎn)前的尿液中有明顯的FITC-CTS峰(峰1，出峰時(shí)間8.0 min)，12 h內(nèi)尿液中排出的全部為FITC-CTS原型，排出量較大，12 h的尿液圖譜(圖5D)基本與空白尿圖譜(圖5A)重合，此時(shí)原型形式的 FITC-CTS基本從體內(nèi)排完，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)FITC-CTS降解的跡象。但24 h點(diǎn)尿液(圖5E)又出現(xiàn)較高的單峰(峰2，出峰時(shí)間13.0 min)，48 h點(diǎn)尿液(圖5F)中此峰基本又消失，根據(jù)此峰出峰時(shí)間和強(qiáng)度分析，認(rèn)為此峰是降解的FITC-CTS產(chǎn)物，可能是體內(nèi)的某種酶將CTS水解形成較小分子量的FITC-CTS和一定的游離單糖或2～8個(gè)單位的小聚合體。人類(lèi)體內(nèi)缺乏水解殼聚糖的兩種酶殼聚糖酶和β-氨基己糖苷酶，溶菌酶不易催化脫乙酰度高于95%的殼聚糖水解，本實(shí)驗(yàn)中殼低聚糖脫乙酰度95%，可能是體內(nèi)溶菌酶對(duì)其部分水解，也可能是體內(nèi)其他酶對(duì)CTS有一定水解，但從尿樣圖譜看，相對(duì)尿液排出FITC-CTS原型量，而降解的FITC-CTS量很少，可能從黏度計(jì)算平均相對(duì)分子質(zhì)量分析不會(huì)有明顯差異。由于FITC-CTS降解的量很少，尿液中FITC-CTS仍以原型排出為主，認(rèn)為少量的降解不影響測(cè)定原型FITC-CTS在體內(nèi)的分布。

圖5 HPGPC色譜檢測(cè)尿液中FITC-CTS及降解物.A～F:0，0.5 h，4 h，12 h，24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)的尿樣的色譜圖，峰1:FITC-CTS;峰2:FITC-CTS降解產(chǎn)物.Fig.5 FITC-CTS and their metabolites in urine detected by HPGPC.

2.3 FITC-CTS在組織、血漿及尿液中的回收率

取等重量或體積的小鼠肝、腎、脾、肺、股骨、血液、尿液和糞，加入生理鹽水配制的 FITC-CTS 0.625，1.25 和 2.5 g·L－1溶液，熒光分光光度法測(cè)定FITC-CTS在各組織中的回收率。根據(jù)回收率公式:R=(∑(Fi×ci))/(∑(ci×ci))(i為樣本號(hào)，ci為FITC-CTS的標(biāo)準(zhǔn)濃度，F(xiàn)i=樣品熒光強(qiáng)度－空白熒光強(qiáng)度)，計(jì)算各組織中FTIC-CTS的回收率，肝、腎、脾、肺、股骨、血漿和尿液中的回收率分別是80.5%，95.3%，78.3%，70.1%，53.1%，93.8% 和98.2%。

2.4 FITC-CTS在體內(nèi)的分布

如圖6所示，小鼠尾靜脈iv給予FITC-CTS 100 mg·kg－1，F(xiàn)ITC-CTS 在血漿中代謝很快，12 h 血漿中FITC-CTS濃度降低90%。圖7顯示分時(shí)間段收集的尿液，1 h內(nèi)尿液中FITC-CTS濃度最高(＞0.8 g·L－1)，1 h 內(nèi)尿液中排出 30%，以后尿液中FITC-CTS濃度隨時(shí)間快速下降，12 h后尿液濃度0.02 g·L－1，24 h 后尿液濃度基本為 0，12 h 內(nèi)尿液排出FITC-CTS 80%以上，24 h內(nèi)90%FITC-CTS排出。圖8顯示腎是FITC-CTS分布濃度和分布量最高的組織，可達(dá)到體內(nèi)組織中 FITC-CTS總量的60%，其次是肝，達(dá)到30%。脾中有很少量分布，肺和股骨中FITC-CTS量基本為零(數(shù)據(jù)未顯示)。FITC-CTS在腎和肝中快速分布，10 min時(shí)腎和肝即有較高量分布，腎中4 h FITC-CTS達(dá)到峰值(0.263 ±0.013)mg，并在 12 h 內(nèi)保持較高濃度，在肝中1 h達(dá)到峰值(0.13 ±0.06)mg，而 48 h后FITC-CTS在腎和肝僅少量殘留。

圖6FITC-CTS在小鼠血漿中的分布情況.±s，n=5.Fig.6 Distribution of FITC-CTS in serum of mice.

圖7FITC-CTS在小鼠尿中分布(A)及排出率(B).±s，n=5.Fig.7 Distribution of FITC-CTS in urine(A)and urine excretion rate(B)in mice.

圖8FITC-CTS在小鼠肝和腎組織中的分布情況.±s，n=5.Fig.8 Distribution of FITC-CTS in liver and kidneys of mice.

3 討論

目前對(duì)殼聚糖體內(nèi)代謝的研究大部分是ig，po方式給藥，因?yàn)闅ぞ厶堑乃苄圆睿灰鬃鳛樗苄宰⑸鋭?，而CTS是低聚短鏈的殼聚糖，保留了殼聚糖的基本性質(zhì)，但可以完全水溶，因此應(yīng)用范圍更廣，目前已經(jīng)有采用水溶性殼聚糖作為藥物緩釋載體的注射劑藥物研究，因此也需要研究殼聚糖注射劑的體內(nèi)代謝。本實(shí)驗(yàn)研究的印跡CTS主要是作為體內(nèi)的有重金屬促排劑為目標(biāo)，除了其重金屬結(jié)合能力外，考察其進(jìn)入體內(nèi)能否易溶、易擴(kuò)散、快速分布到靶器官、快速排除體外無(wú)殘留以及不參與體內(nèi)物質(zhì)代謝或其他化學(xué)變化，這些組織分布、排泄和體內(nèi)降解特點(diǎn)是判斷其能否作為體內(nèi)促排劑的關(guān)鍵。

N-乙酰化殼聚糖能被人體血清中的溶菌酶部分水解，Onishi等［10］研究50%脫乙酰度的殼聚糖可被溶菌酶快速水解2～8個(gè)單糖的低聚體殼聚糖，但隨脫乙酰化程度增高溶菌酶水解殼聚糖能力下降，脫乙酰度高于95%的殼聚糖不易被水解。本研究中的CTS脫乙酰度為95%，且分子量較普通殼聚糖分子量大大降低，已經(jīng)是低聚體殼聚糖，溶菌酶水解測(cè)定結(jié)果為不易被溶菌酶水解，與文獻(xiàn)結(jié)果是一致的，這個(gè)特點(diǎn)也符合體內(nèi)促排劑在體內(nèi)不代謝降解的要求。

殼聚糖在組織和血液中的分布與其性質(zhì)有關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量較低的殼聚糖更易于快速進(jìn)入組織和血液，而相同分子量的殼聚糖，水溶性的樣品更快速地在組織和血液中分布［11］。本實(shí)驗(yàn)中水溶性CTS iv給予后快速?gòu)难獫{轉(zhuǎn)移，這與血漿特殊的迅速轉(zhuǎn)運(yùn)能力有關(guān)，也與此CTS相對(duì)分子質(zhì)量2460遠(yuǎn)小于普通殼聚糖(50 000)更易透過(guò)血管相關(guān)。大部分FITC-CTS快速分布到腎中，并從腎中快速清除，通過(guò)尿液排出體外，有研究大鼠注射給予［3H］殼聚糖也證明殼聚糖主要經(jīng)腎排泄［12］。iv給予FITC-CTS后可快速排出體外，ip［10］和 ig［13］給予殼聚糖后也都可快速排出。FITC-CTS主要分布到了有大血管分布的器官，60%分布到腎，30%可分布到肝，極少部分可分布到脾，其他組織基本無(wú)分布。雖然CTS殼聚糖相對(duì)分子質(zhì)量大大降低，但仍為大分子物質(zhì)，iv給藥后主要通過(guò)血液分布到各組織。

本研究中制備的印跡CTS，螯合重金屬性能強(qiáng)，易溶，具有明顯的腎靶向性，快速?gòu)难獫{轉(zhuǎn)移至腎，12 h內(nèi)保持較高的濃度，48 h后體內(nèi)基本無(wú)殘留，而且這種低聚合物體內(nèi)基本不發(fā)生降解，主要以原型排出體外。這些代謝分布特點(diǎn)，基本符合體內(nèi)促排劑的要求。在下一步的研究中，結(jié)合體內(nèi)代謝分布特點(diǎn)和體外細(xì)胞水平評(píng)價(jià)，將進(jìn)一步研究這種印跡CTS在體內(nèi)促排有害重金屬的效率和促排的選擇性，為開(kāi)發(fā)新型的體內(nèi)促排藥物奠定基礎(chǔ)。

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