李愛春 張林 周君來 孫學(xué)軍

1 浙江體育職業(yè)技術(shù)學(xué)院（杭州 310012） 2 蘇州大學(xué)體育學(xué)院 3 浙江工業(yè)大學(xué) 4 第二軍醫(yī)大學(xué)

國內(nèi)外研究表明，氫氣是一種優(yōu)質(zhì)抗氧化物質(zhì)，通過呼吸氫氣或飲用、注射含氫液體——?dú)渌?，可治療缺血再灌注損傷［1-3］、神經(jīng)損傷［4］、器官炎癥［5，6］、藥物毒性［7］、小鼠基因缺陷［8］、帕金森?。?］和人類II型糖尿?。?0］等慢性氧化應(yīng)激損傷，其基礎(chǔ)是氫氣的選擇性抗氧化作用［1］，即選擇性中和羥自由基和亞硝酸陰離子等導(dǎo)致氧化損傷重要介質(zhì)的能力。而有關(guān)氫水抗氧化作用的研究剛起步，已有的研究多集中于醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，在體育科研領(lǐng)域迄今尚無涉足，有關(guān)氫水對運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激損傷的防治研究仍屬空白。本實(shí)驗(yàn)以骨骼肌為研究對象，探討氫水對力竭運(yùn)動(dòng)大鼠氧化應(yīng)激損傷的影響，為評價(jià)氫水生物學(xué)作用和運(yùn)動(dòng)氧化損傷防治提供新的思路與方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組

浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的30只清潔級健康雄性SD大鼠，3月齡，體重300～350g，按體重配對后隨機(jī)分成安靜對照組（C組）、運(yùn)動(dòng)對照組（E組）與運(yùn)動(dòng)給氫組（H組）3組，每組10只。分籠飼養(yǎng)，每籠2只，自由飲食飲水。飼料、智能屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室及動(dòng)物飼育管理均由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院統(tǒng)一提供，光照時(shí)間為8:00～18:00，動(dòng)物室內(nèi)溫度22±3℃，相對濕度為50±5%。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前均未進(jìn)行過跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

氫水購自上海基量標(biāo)準(zhǔn)氣體有限公司。氫氣飽和生理鹽水的制備: 在0.5 MPa壓力下加壓暴露4 h，將純氫氣溶解于正常生理鹽水中達(dá)到飽和，4℃貯存。

C組不運(yùn)動(dòng)。正式實(shí)驗(yàn)前2天，E組和H組每天進(jìn)行1次適應(yīng)性低強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)（BCPT-98型電動(dòng)動(dòng)物跑臺(tái)由杭州段式提供），坡度0，速度10 m·min-1，持續(xù)10 min。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，H組于運(yùn)動(dòng)前腹腔注射10 ml·kg-1體重氫水，E組腹腔注射同體積生理鹽水，后采用Marra方案［11］進(jìn)行一次性大強(qiáng)度力竭跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。坡度0，初始速度10 m·min-1，10 min內(nèi)增加至28 m·min-1（超過90%VO2max），持續(xù)運(yùn)動(dòng)至力竭。運(yùn)動(dòng)時(shí)使用聲、光或毛刷刺激大鼠尾部以保證運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。力竭判定標(biāo)準(zhǔn)：運(yùn)動(dòng)末期動(dòng)物不能堅(jiān)持原跑速，先后滯留跑道后1/3處達(dá)3次以上，刺激驅(qū)趕無效，停跑后體征表現(xiàn)為呼吸急促，神情倦怠，腹臥位，對刺激反應(yīng)遲鈍。

1.3 取材與指標(biāo)測試

E組和H組均于力竭運(yùn)動(dòng)后3 h采用股動(dòng)脈放血法處死，取兩側(cè)后肢腓腸肌中段，剔除筋膜，迅速置于干冰中冷凍待測。整個(gè)取樣時(shí)間約1 min。同樣方法處死C組，取腓腸肌，待測。

試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。采用化學(xué)比色法測定SOD、MDA、GSH、TAOC活性，采用Elisa法測試3-硝基酪氨酸（3-NT）和8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用EXCEL和SPSS軟件對所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和雙因素方差分析，結(jié)果以± s表示。P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌氧化應(yīng)激指標(biāo)

表1顯示，與C組比較，E組3-NT、MDA與8-OHdG 均顯著升高（P < 0.05，P < 0.01，P < 0.01），H組3-NT無明顯變化，MDA顯著低于C組（P <0.01），8-OHdG濃度顯著高于C組（P < 0.05）；與E組比較，H組3-NT無顯著變化，MDA、8-OHdG均顯著降低（P < 0.01，P < 0.05）。

2.2 骨骼肌抗氧化酶活性

表2顯示，與C組比較，E組SOD、GSH活性顯著降低（P < 0.05），TAOC有所降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；H組SOD、GSH、TAOC活性與C組比較無明顯差異；但顯著高于E組（P < 0.01，P <0.01，P < 0.05）。

表2 各組大鼠骨骼肌抗氧化酶活性比較

3 討論

氧化應(yīng)激是指機(jī)體組織或細(xì)胞內(nèi)氧自由基生成增加和／或清除能力降低，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)蓄積而引起的氧化損傷過程。氧自由基在體內(nèi)具有不穩(wěn)定性和較高的化學(xué)反應(yīng)性，可以攻擊蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及DNA等生物分子，形成一系列氧化損傷產(chǎn)物［12］。3-NT是活性氧存在的條件下，高毒性的過氧亞硝酸（ONOO-）使游離酪氨酸或蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化形成的穩(wěn)定的終末代謝物，是蛋白質(zhì)硝基化的特異性標(biāo)志物，是介導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷作用的重要環(huán)節(jié)，是近年來細(xì)胞損傷機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一。研究顯示，在氧化應(yīng)激過程中，3-NT的產(chǎn)生可引起細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)和酶變性失活、DNA損傷、細(xì)胞死亡和凋亡［13］。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，是反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平的敏感指標(biāo)，檢測MDA水平可間接反應(yīng)氧化膜氧化損傷反應(yīng)的程度。8-OHdG是DNA組分之一的脫氧鳥苷在活性氧作用下的特異產(chǎn)物，是內(nèi)源性及外源性因素導(dǎo)致DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物［14］。在體育科研領(lǐng)域，MDA是運(yùn)動(dòng)氧化損傷防治的常用指標(biāo)，而有關(guān)3-NT、8-OHdG的研究甚少。

本研究結(jié)果表明，力竭運(yùn)動(dòng)使骨骼肌氧自由基增加，抗氧化酶活性降低，氧化應(yīng)激加強(qiáng)，引起骨骼肌細(xì)胞酪氨酸殘基硝化、脂質(zhì)過氧化與DNA羥化，導(dǎo)致大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)氧化、脂質(zhì)過氧化與DNA損傷。氫水降低了上述損傷，對力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。其保護(hù)作用的基礎(chǔ)可能是氫水的選擇性抗氧化。由于氫還原性較弱，不與信號作用、氧化作用弱的活性氧直接反應(yīng)，但與活性強(qiáng)、毒性強(qiáng)的活性氧，如ONOO-與OH-直接發(fā)生反應(yīng)。Gharib［5］等研究認(rèn)為氫氣與OH-直接反應(yīng)是治療炎癥等損傷的基礎(chǔ)。Ohsawa［1］等采用化學(xué)反應(yīng)、細(xì)胞學(xué)等實(shí)驗(yàn)證明，氫氣溶解在液體中可選擇性中和氧化損傷的重要介質(zhì) — ONOO-與OH-，直接清除毒性強(qiáng)的氧自由基，起到自由基清除劑的作用。

本研究中，一次性力竭運(yùn)動(dòng)后大鼠骨骼肌SOD、GSH含量下降，可能與運(yùn)動(dòng)中胰高糖素、兒茶酚胺和血管加壓素釋放增加有關(guān)。TAOC下降可能與運(yùn)動(dòng)中活性氧高水平產(chǎn)生，血流改變、能量供應(yīng)與還原態(tài)能量利用能力降低有關(guān)［15］。補(bǔ)充氫水組SOD、GSH與TAOC活性升高可能與氫氣的特性有關(guān)。氫氣具有低密度、小分子、易擴(kuò)散的特性，可有效改善微循環(huán)，降低微循環(huán)阻抗，因而增加組織供氧，降低氧化應(yīng)激。另一方面，由于抗氧化的源頭是能源物質(zhì)代謝，氫水可能參與了能量代謝，影響NAPH氧化酶的產(chǎn)生，發(fā)揮了信號作用［10，16］。這提示氫氣可能是一種新的生物活性物質(zhì)，具有廣泛的應(yīng)用前景。

4 總結(jié)

氫水能降低骨骼肌ONOO-、過氧化脂質(zhì)類與OH-等的代謝水平，提高骨骼肌抗氧化酶活性，增強(qiáng)骨骼肌的總抗氧化能力，改善力竭運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌蛋白質(zhì)氧化損傷、脂質(zhì)過氧化損傷及DNA損傷，對骨骼肌運(yùn)動(dòng)性氧化應(yīng)激損傷具有保護(hù)作用。

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