程智勇，韓 猛，門曉彥，易喜賢

（1.河北省秦皇島市第一醫(yī)院普外一科，河北秦皇島 066000；2.河北省秦皇島市海港醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北秦皇島 066000）

抑癌基因RUNX3在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

程智勇1，韓 猛1，門曉彥2，易喜賢1

（1.河北省秦皇島市第一醫(yī)院普外一科，河北秦皇島 066000；2.河北省秦皇島市海港醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北秦皇島 066000）

目的探討胃癌組織中RUNX3基因表達(dá)與胃癌臨床病理的關(guān)系及其對預(yù)后的判斷價值。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP技術(shù)和圖像分析技術(shù)，研究RUNX3在胃癌和正常胃黏膜組織中的表達(dá)情況及陽性表達(dá)面積、強陽性表達(dá)面積，分析與病理參數(shù)的關(guān)系，并采用Kap1an-Meier生存曲線分析不同表達(dá)水平對術(shù)后生存率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織RUNX3表達(dá)陽性率、陽性面積、強陽性面積均明顯低于正常胃黏膜組織（P＜0.01）。胃癌組織RUNX3表達(dá)與胃癌組織分化程度、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移、腫瘤分期明顯正相關(guān)（r=0.86，P＜0.05），術(shù)后3、5年生存率低表達(dá)者明顯低于高表達(dá)者（P均＜0.05）。結(jié)論RUNX3基因表達(dá)低下或丟失與胃癌發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為預(yù)測胃癌患者術(shù)后生存率的指標(biāo)。

胃腫瘤；基因表達(dá)；免疫組織化學(xué)

胃癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，遺傳因素也在其中扮演著重要角色。新近研究發(fā)現(xiàn)［1］，人類runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因3（runtre1ated transcription factor gene 3，RUNX3）可能也是一種抑癌基因，且在人類正常組織器官的形成以及在某些組織的癌變過程中可能起著重要作用。2010年5月—2011年1月，我們采用免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)合圖像定量分析RUNX3在胃癌不同臨床病理參數(shù)下的表達(dá)差異及對預(yù)后判斷的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料：胃癌組82例，為本院外科手術(shù)后隨訪生存超過5年的胃癌患者手術(shù)切除標(biāo)本，病理檢查診斷明確。腫瘤大小、部位、大體類型及漿膜受侵狀態(tài)、摘除之淋巴結(jié)分組均根據(jù)手術(shù)記錄。胃癌組患者中，男性60例，女性22例，年齡30～78歲，中位年齡56歲。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟分級標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ、Ⅱ期胃癌59例，Ⅲ、Ⅳ期23例。對照組30例，同期經(jīng)胃鏡及病理診斷的正常胃黏膜組織。男性18例，女性12例，年齡32～74歲，平均52歲。

1.2 主要試劑與儀器：鼠抗人RUNX3單克隆抗體（Anti-dobi Diagnisica，Inc，USA，購自美國Santq Gruz公司），SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自邁新公司。Axiop1an 2 imaging顯微圖像分析系統(tǒng)（ZEISS，Germany）。

1.3 免疫組織化學(xué)染色：標(biāo)本甲醛固定，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)SP技術(shù)檢測標(biāo)本中RUNX3表達(dá)，高溫、高壓修復(fù)抗原。每批實驗均設(shè)有陰性、陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，已知陰性切片做陽性對照。RUNX3表達(dá)以胃腺上皮細(xì)胞或癌細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)明顯的黃色、棕黃色或黃褐色顆粒為陽性細(xì)胞。

1.4 圖像分析：所有切片圖像經(jīng)Axiop1an 2多功能全自動熒光顯微鏡和AxioCan數(shù)碼相機真彩輸入，畫面130萬像素。圖像經(jīng)增強、分割和二值化處理，通過KS400圖像分析系統(tǒng)（Ver，3.0）對圖像識別及圖像分析處理以選取測量參數(shù)自動測量和分析，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換到Exce1進(jìn)一步分析處理。經(jīng)上述處理后，得到陽性表達(dá)面積和強陽性表達(dá)面積。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行分析，計量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗和χ2檢驗，術(shù)后生存率采用Kap1an-Meier生存曲線分析，同時采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RUNX3表達(dá)陽性率：胃癌組RUNX3表達(dá)陽性率為41.5%（34/82），顯著低于對照組的100.0%（30/30）（P＜0.01）。胃癌中RUNX3表達(dá)的陽性面積、強陽性面積分別為（5 028.41±150.22）μm2、（1 724.85±50.22）μm2，對照組分別為（13 824.08 ±352.61）μm2、（6 868.72±201.84）μm2，胃癌組均明顯低于對照組（P＜0.01）。

2.2 胃癌組織RUNX3表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系：腫瘤分化程度、浸潤深度以及漿肌層淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 胃癌組織RUNX3表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系Table 1 Correlation between the expression of RUNX3 in gastric carcinoma tissue and related clinicopathological parameters（±s，A/μm2）

表1 胃癌組織RUNX3表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系Table 1 Correlation between the expression of RUNX3 in gastric carcinoma tissue and related clinicopathological parameters（±s，A/μm2）

*P＜0.01 vs same itemsby t test

C1inicopatho1ogica1 parameters n Positive expression area Strong positive expression area Gender Ma1e 60 6 724.44±232.31 2 243.16±157.42 Fema1e 22 6 083.57±203.26 2 017.55±100.11 Age≤50 years o1d 23 6 843.65±223.64 2 354.42±108.18＞50 years o1d 59 5 987.80±211.85 1 743.80±98.22 Tumor diameter≤3.0cm 45 5 984.21±241.24 3 043.24±150.22＞3.0cm 37 5 812.79±151.15 2 998.48±100.12 Differentiation 1eve1*High and moderate 35 7 550.28±283.45 3 001.51±150.11 Low 47 3 164.84±162.84 9 23.84±105.26 Infi1trating depth*Mucosa/submucosa 21 8 424.64±185.69 4 228.62±174.65 Muscu1ar 1ayer/serosa 61 3 226.23±166.15 945.81±100.12 Lymph nodemetastasis*No 55 9 984.04±392.44 3 024.14±118.11 Yes 27 3 122.12±116.14 926.43±99.45 Tumor stage*Ⅰ/Ⅱ59 9 642.84±211.15 3 083.16±150.21Ⅲ/Ⅳ23 1 521.54±135.45 948.88±25.66

2.3 RUNX3表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系：若以胃癌組織RUNX3表達(dá)陽性面積＞7 000μm2或強陽性面積＞3 000μm2為高表達(dá)，陽性面積＜4 000μm2或強陽性面積＜1 000μm2為低表達(dá)，Kap1an-Meier生存曲線分析顯示，RUNX3高表達(dá)者術(shù)后累計生存率顯著高于低表達(dá)者（P＜0.05）。高表達(dá)者術(shù)后3、5年生存率分別為80.6%（29/36）與58.3%（21/36），顯著高于低表達(dá)者56.5%（26/46）與34.7%（16/ 46）（P＜0.05）。

3 討 論

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，占男性第2位，女性第3位，其病死率為惡性腫瘤之首［2-3］。胃癌的患病率存在著明顯的地區(qū)差異，在全球范圍內(nèi)，以亞洲的日本、韓國和中國為最高［4］。盡管近年來世界胃癌的患病率和病死率有下降的趨勢，但每年的新發(fā)病例約有35%發(fā)生在中國［5］；目前仍是我國患病率和病死率最高的惡性腫瘤之一［6-7］。人類RUNX3基因位于染色體1p36.1，全長約67 kb；RUNX3蛋白是由α亞單位和β亞單位構(gòu)成的含415個氨基酸殘基的異二聚體。有研究顯示［1］，RUNX3可能與胃黏膜上皮腫瘤的形成具相關(guān)性。也有研究認(rèn)為［8］，RUNX3在胃癌中表達(dá)的下調(diào)或缺失可能與其啟動子的高度甲基化有關(guān)；敲除小鼠的RUNX3基因后，其胃黏膜上皮細(xì)胞可出現(xiàn)增生肥大。本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中無論從RUNX3的陽性表達(dá)面積或強陽性表達(dá)面積，均與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期顯著相關(guān)，但與患者性別、年齡、腫瘤大小無明顯相關(guān)。本研究胃癌組織中RUNX3陽性表達(dá)率顯著低于正常胃組織，說明RUNX3調(diào)控能力下降，從而導(dǎo)致胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

研究還發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中RUNX3表達(dá)程度顯著影響患者術(shù)后生存期，Kap1an-Meier生存曲線分析顯示，胃癌組織中RUNX3高表達(dá)者術(shù)后累計生存率顯著高于低表達(dá)者，RUNX3高表達(dá)者術(shù)后3、5年生存率均顯著高于低表達(dá)者?？梢?，檢測胃癌組織中RUNX3表達(dá)水平，有利于預(yù)測患者預(yù)后。以往胃癌基因表達(dá)均采用免疫組織化學(xué)染色后計算表達(dá)陽性百分率，數(shù)據(jù)只能進(jìn)行半定量分析，其本質(zhì)是定性研究。本研究試圖采用圖像定量分析法［6］，將所有切片均經(jīng)Axiop1an 2多功能全自動熒光顯微鏡，通過KS400圖像分析系統(tǒng)得到陽性表達(dá)面積和強陽性表達(dá)面積，然后進(jìn)行定量統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)不但能反映是否有陽性表達(dá)，而且可通過陽性面積和強陽性面積反映RUNX3表達(dá)的強弱。綜上所述，RUNX3基因可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中起重要作用，今后通過進(jìn)一步研究導(dǎo)致其表達(dá)下調(diào)的具體機制，可能有助于揭示胃癌發(fā)生、發(fā)展本質(zhì)。

［1］ITO K，LIU Q，SALTO-TELLEZM，et a1.RUNX3，a nove1 tumor suppressor，is frequent1y inactivated in gastric cancer by protein mis1oca1ization［J］.Cancer Res，2005，65（17）：7743-7750.

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（本文編輯：趙麗潔）

EXPRESSION AND CLINICAL SIGNIFICANCE OF ANTI-ONCOGENE RUNX3 IN GASTRIC CARCINOMA

CHENG Zhiyong1，HAN Meng1，MEN Xiaoyan2，YIXixian1
（1.The Frist Departmentof Greneral Surgery，the First Hospital of Qinhuangdao City，Hebei Province，Qinhuangdao 066000，China；2.Departmentof Endocrinology，the Haigang Hospital of Qinhuangdao City，Hebei Province，Qinhuangdao 066000，China）

ObjectiveTo study the expression of anti-oncogene runt-re1ated transcription factor gene 3（RUNX3）and its c1inica1 significance in gastric carcinoma patho1ogy and prognosis.MethodsSP immunohistochemistry and image ana1ysis were used for studying the gene expression，positive expression area and strong positive expression area of RUNX3 in gastric carcinoma tissue and norma1gastric mucosa tissue.The inf1uence of different expression 1eve1s on postoperative surviva1 rates was ana1yzed with Kap1an-Meier surviva1curves.ResultsPositive percentage，positive expression area and strong positive expression area of RUNX3 expression in gastric carcinoma tissue were much higher than those in norma1gastric mucosa tissue（P＜0.01）.Expression of RUNX3 in gastric carcinoma tissue was re1ated to differentiation degree，infi1tration depth，1ymphatic metastasis and tumor stage in gastric carcinoma tissue obvious1y.As for postoperative surviva1 rates for 3 and 5 years，itwas obvious1y that the hypo-expresserswere 1ower than hyper-expressers.ConclusionDecreased or 1ost expression of antioncogene RUNX3 corre1ateswith occurrence，infi1tration and metastasis of gastric carcinoma，and it can be used as a prognosis indication for postoperative surviva1 rates.

stomach neop1asms；gene expression；immunohistochemistry

R735.2

A

1007-3205（2011）10-1135-03

2011-07-04；

2011-08-25

程智勇（1977-），男，河北秦皇島人，河北省秦皇島市第一醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事普外科疾病診治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2011.10.007