王玉梅 曹 凱 劉永平 秦博文 商亞珍

(河北省重要研究與開發(fā)重點實驗室/承德醫(yī)學院中藥研究所，承德 067000)

慢性腦缺血是指各種原因引起長期的腦灌流不足，伴發(fā)于多種臨床神經(jīng)系統(tǒng)性疾病，如動脈粥樣硬化、血管性癡呆及阿爾茨海默病等。而這些疾病的發(fā)生涉及膽堿能系統(tǒng)、一氧化氮、興奮性氨基酸、線粒體損傷及氧化自由基系統(tǒng)等多方面［1-2］。其中膽堿能系統(tǒng)和一氧化氮及其合成酶的異常變化與腦缺血損傷引起的神經(jīng)功能障礙密切相關，已經(jīng)得到研究人員的高度重視。

目前，在臨床上采用一系列方法治療腦缺血引起的神經(jīng)損傷，而中藥復方或其提取活性成分在防治缺血性腦損傷方面已顯示出良好的效果，并已成為研究的熱點。黃芩莖葉黃酮(flavonoids from stem and leaf of scutellaria baicalensis georgi，SSF)是從中藥黃芩地上部分提取分離的黃酮類化合物，本實驗室先前利用多種體內外模型已經(jīng)確定了SSF具有抗炎、抗氧化、抗缺氧和改善記憶障礙等作用［3-6］。本研究采用大鼠雙側頸總動脈結扎建立慢性腦缺血模型，利用大鼠Morris水迷宮行為實驗和免疫組織化學的方法，進一步探討SSF對腦缺血性記憶障礙的改善作用，并通過測定腦內膽堿乙酰轉移酶(chloine acetyltransferase，ChAT)和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)蛋白表達揭示其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑

健康雌性SD大鼠300～320 g，購買于河北醫(yī)科大學實驗動物中心(合格證編號:90912);SSF(承德醫(yī)學院中藥研究所提供);抗ChAT、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)抗體、免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 大鼠慢性腦缺血模型制備及分組給藥

60只雌性SD大鼠，術前禁食12 h，禁水4 h。稱體質量后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉(mL/kg)。取仰臥位將大鼠固定在手術臺上，去毛剪頸內部去毛、強力碘消毒后沿頸正中切開，分離雙側頸總動脈，并套以“0”號線，待動物清醒后結扎雙側頸總動脈。假手術組大鼠(8只)做同樣手術但不結扎雙側頸總動脈。手術期間確保大鼠能自主呼吸且肛溫保持在31.5℃～37.5℃。術后每只動物腹腔注射8萬單位的青霉素鈉預防細菌感染，并送至溫度為22℃±1℃的動物房飼養(yǎng)，觀察。術后30 d進行水迷宮篩選，成模率為75%。將造模成功的大鼠按數(shù)字表法完全隨機設計分為 4 組:模型組，17.5、35.0 和 70.0 mg/kg SSF 3個劑量給藥組，各8只。在手術第35天開始灌胃給藥，給藥30 d后進行水迷宮測試。連續(xù)給藥38 d直至取材，假手術組和模型組灌胃等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.3 大鼠學習記憶能力的測試

1.3.1 Morris水迷宮

水迷宮是一直徑為120 cm，高50 cm的不銹鋼圓形水池。迷宮上方裝有攝像頭，并與安裝有處理軟件的電腦相連。人為將水池等分成4個象限，將一個直徑10 cm，高30 cm的平臺放在任意一個象限正中。實驗時加入足量碳素墨水并使水面高于平臺1.5 cm，水溫控制在23℃ ±1℃。具體測試方法參照文獻［7］。水迷宮共測試6 d。

1.3.2 定位航行測試

定位航行實驗2 d:第1天和第2天(即術后第65天和第66天)，各組大鼠在術后第65天即給藥30 d以后，進行定位航行實驗，每日2次測試找到平臺的游泳路程的平均值作為當天大鼠的學習成績，測試期間繼續(xù)給藥。

1.3.3 空間搜索測試

空間搜索實驗用于檢測大鼠的記憶保持能力，測試第3天，即大鼠在術后第67天(定位航行實驗結束后)，將水迷宮中平臺撤去，任選一個入水點(近端或者遠端)將大鼠面向池壁放入水中，記錄各組大鼠60 s內在目標象限的游泳路程和4個象限總的游泳路程，以2者的比值(即目標象限游泳路程百分比)作為當天的學習成績，測試期間繼續(xù)給藥。

1.3.4 再學習能力測試

再學習能力測試3 d:第4天、第5天和第6天，術后第68天將迷宮中的平臺移至目標象限的對面，記錄各組大鼠找到平臺的游泳路程，每日2次測試找到平臺的游泳路程的平均值作為當天的學習成績。測試期間繼續(xù)給藥。

1.4 ChAT和一氧化氮合酶蛋白表達的檢測

采用免疫組織化學的方法檢測大鼠海馬細胞中ChAT、nNOS、iNOS和eNOS蛋白的表達。各組大鼠在術后第72天，末次灌胃給藥60 min后，大鼠乙醚麻醉，斷頭冰上取腦，將右腦用4%甲醛固定24 h，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片，片厚5 μm。免疫組化標記采用(streptomycin avidin-biotin-peroxidase complex，SABC)法測定海馬細胞中ChAT、nNOS、iNOS和 eNOS蛋白的表達情況，以細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，每組大鼠選6張切片，每張切片按數(shù)字表法隨機采集6個視野，應用MiVnt圖像分析系統(tǒng)進行圖像分析，以陽性細胞面積與視場面積比值的平均值來表示各組陽性表達信號的強弱。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 11.5進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差()表示，水迷宮數(shù)據(jù)采用two-way ANOVA進行處理，其他數(shù)據(jù)組間多樣本均數(shù)間比較采用one-way ANOVA分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SSF對慢性腦缺血大鼠Morris操作的影響

2.1.1 SSF對慢性腦缺血大鼠定位航行實驗的影響

定位航行實驗發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組大鼠2 d找到平臺的游泳路程分別延長100.28%(P=0.001)和115.46%(P=0.001)，差異具有統(tǒng)計學意義。SSF 17.5、35.0 和 70.0 mg/kg 治療組與模型組相比均可顯著縮短，大鼠找到平臺的游泳路程差異具有統(tǒng)計學意義(圖1)。

2.1.2 SSF對慢性腦缺血大鼠空間探索實驗的影響

圖1 SSF對慢性腦缺血大鼠在Morris水迷宮操作中定向航行實驗和再學習能力的影響Fig.1 Effects of SSF on directional sailing and relearning ability in chronic cerebral ischemia rats with Morris water maze task

空間探索實驗發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組大鼠在60 s內目標象限游泳路程的百分比顯著減少了49.40%(P=0.001);而 SSF 17.5、35.0 和 70.0 mg/kg灌胃給藥30 d能使慢性腦缺血大鼠在目標象限游泳路程的百分比分別增加了21.44%(P=0.043)、52.23%(P=0.001)和 62.43%(P=0.001)。而且從游泳軌跡上可以看出，SSF17.5、35.0 和 70.0 mg/kg灌胃給藥30 d后能明顯增加慢性腦缺血大鼠在目標象限的游泳路程和穿越平臺的次數(shù)(圖2)。

2.1.3 SSF對慢性腦缺血大鼠再學習能力的影響

在3 d的再學習能力實驗中發(fā)現(xiàn)，與假手術相比，模型組大鼠找到平臺的游泳路程顯著延長，分別延長了73.30%(P=0.001)、125.49%(P=0.001)和129.30%(P=0.001)，差異具有統(tǒng)計學意義。SSF 17.5、35.0 和70.0 mg/kg灌胃給藥 30 d 均可明顯縮短大鼠找到平臺的游泳路程且差異具有統(tǒng)計學意義(圖1)。

2.2 SSF對慢性腦缺血大鼠海馬細胞中ChAT蛋白表達的影響

免疫組織化學檢測大鼠海馬細胞中ChAT蛋白表達的結果發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組大鼠海馬中ChAT免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)量減少了162.56%(P=0.001);而 17.5、35.0 和 70.0 mg/kg SSF 治療38 d能不同程度的增加模型組大鼠海馬細胞中ChAT蛋白的表達，細胞胞質和胞膜均著黃褐色。3個劑量的藥物使海馬細胞中ChAT免疫陽性細胞表達分別增加了46.25%(17.5 mg/kg SSF，P=0.028)、70.60%(35 mg/kg SSF，P=0.002)和 124.67%(70 mg/kg SSF，P=0.001)(圖3，表1)。

2.3 SSF對慢性腦缺血大鼠海馬細胞中nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達的影響

表1 SSF對慢性腦缺血大鼠海馬細胞中ChAT、nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達的影響Tab.1 Effects of SSF on ChAT，nNOS，iNOS，eNOS expression of hippocampus in chronic cerebral ischemia rats()(n=6)

表1 SSF對慢性腦缺血大鼠海馬細胞中ChAT、nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達的影響Tab.1 Effects of SSF on ChAT，nNOS，iNOS，eNOS expression of hippocampus in chronic cerebral ischemia rats()(n=6)

#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs sham-operated group;* P ＜0.05，＊＊ P ＜0.01 vs model group;SSF:flavonoids from stem and leaf of scutellaria baicalensis georgi;ChAT:choline acetyltransferase;nNOS:neuronal nitric oxide synthase;iNOS:inducible nitric oxide synthase;eNOS:endothelial nitric oxide synthase.

ChAT nNOS iNOS eNOS Sham － 0.050 ±0.008 0.020 ±0.006 0.022 ±0.010 0 Group Dose/(mg·kg－1).081 ±0.016 Model － 0.019 ±0.005## 0.050 ±0.010## 0.090 ±0.016## 0.017 ±0.006##SSF 17.5 0.028 ±0.002* 0.038 ±0.008* 0.073 ±0.013* 0.033 ±0.012*35 0.032 ±0.005＊＊ 0.032 ±0.006＊＊ 0.041 ±0.009＊＊ 0.040 ±0.014＊＊70 0.043 ±0.010＊＊ 0.024 ±0.006＊＊ 0.028 ±0.008＊＊ 0.069 ±0.015＊＊

免疫組化檢測大鼠海馬細胞中nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達的結果發(fā)現(xiàn)，與假手術組相比，模型組大鼠海馬細胞中nNOS和iNOS免疫陽性表達明顯增加，細胞胞體棕色顆粒較多;eNOS免疫陽性細胞明顯減少。而17.5、35.0 和70.0 mg/kg SSF 治療38 d 能不同程度的降低模型組大鼠海馬細胞中nNOS和iNOS蛋白的表達，增加模型組大鼠海馬細胞中eNOS蛋白的表達，3個劑量的藥物使海馬細胞中nNOS和iNOS免疫陽性細胞表達分別減少了22.69%，19.45%(17.5 mg/kg SSF)、35.75%，54.90%(35 mg/kg SSF)和52.03%，68.85%(70 mg/kg SSF);eNOS 免疫陽性細胞表達分別增加了 92.47%(17.5 mg/kg SSF)、136.91%(35 mg/kg SSF)和 305.59%(70 mg/kg SSF)(圖4～6，表1)。

圖4 SSF對慢性腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)nNOS蛋白表達的影響Fig.4 Photomicrograph of nNOS immunostainning of hippocampus in chronic cerebral ischemia rats(DAB stain 400×)

3 討論

慢性腦缺血是神經(jīng)系統(tǒng)的一種常見病理狀態(tài)，臨床上主要表現(xiàn)為學習、記憶及空間辨別能力明顯下降。利用雙側頸總動脈永久性結扎模型，模擬慢性腦低灌注狀態(tài)，可以部分復制臨床慢性腦缺血，是目前普遍認同的用于慢性腦低灌注研究的動物模型［8］。陳濤等［9］用 Morris水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)，慢性腦缺血8周后，與假手術組相比，缺血組大鼠空間學習記憶能力有損害，逃避潛伏期顯著延長，定位能力欠佳，穿越目標平臺的次數(shù)減少，差異顯著。學習和記憶功能包括3個基本過程，記憶獲得、記憶鞏固和記憶保持。本實驗利用Morris水迷宮，主要通過定位航行實驗檢測動物的空間記憶獲得的能力、空間探索實驗評價記憶保持能力以及再學習能力測試檢測各組大鼠的再學習能力，全面地評價了大鼠的認知功能。檢測結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠找到平臺的游泳路程顯著延長，而 17.5、35.0 和70.0 mg/kg SSF 治療組大鼠在這6 d的測試中找到平臺的游泳路程與模型組相比均明顯縮短，并且在探索實驗中SSF高、中、低3個劑量均能明顯增加慢性腦缺血大鼠在目標象限的游泳路程百分比和穿越平臺的次數(shù)。表明SSF能夠提高腦缺血動物的學習記憶能力，明顯改善慢性腦缺血造成的大鼠學習記憶功能下降。

膽堿能系統(tǒng)與記憶的形成和貯存密切相關。ChAT免疫組織化學［10］表明海馬CA1區(qū)ChAT免疫反應陽性神經(jīng)元和纖維數(shù)量明顯減少，與大鼠的學習記憶障礙程度呈正相關。大鼠缺血再灌后腦內乙酰膽堿濃度下降，同時給予擬膽堿能藥物能改善學習記憶功能［11］。因此，血管性癡呆的記憶功能障礙與中樞膽堿能系統(tǒng)有著必然的聯(lián)系。已有證據(jù)［12］表明，海馬是參與學習和記憶功能的重要部位，且與海馬膽堿能系統(tǒng)直接相關。本實驗結果顯示，雙側頸總動脈結扎2個月后，模型組大鼠海馬細胞中膽堿乙酰轉移酶ChAT免疫反應陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，而17.5、35.0 和70.0 mg/kg SSF 治療38 d能不同程度的增加大鼠海馬細胞中ChAT蛋白的表達，細胞胞質和胞膜均著黃褐色。綜上所述，海馬細胞中ChAT蛋白表達下降參與了腦缺血的損傷過程，SSF通過提高海馬細胞中ChAT蛋白的表達，改善了腦缺血大鼠的膽堿能系統(tǒng)功能，進而改善了其學習記憶能力。

目前認為腦缺血后大量一氧化氮(nitric oxide，NO)產(chǎn)生，能破壞膽堿能神經(jīng)元，使額葉、海馬等腦區(qū)神經(jīng)元受損，最終出現(xiàn)學習記憶障礙和癡呆等病癥。在腦缺血的各個階段NO的產(chǎn)生均有所增加，過多NO與過氧化物反應生成過硝酸鹽，造成蛋白質、核酸和脂質膜損傷，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。在正常情況下，NO在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要有調節(jié)腦血流量、抗血小板和白細胞聚集黏附和參與神經(jīng)突觸的信息傳遞等生物學作用。但是在病理情況下，過量NO則表現(xiàn)出毒性作用［13］。NOS是NO合成最關鍵的限速酶，其含量及活性的變化直接影響NO的生成量。目前已確定的NOS有3種亞型:神經(jīng)元型NOS(nNOS)、誘導型NOS(iNOS)和內皮型NOS(eNOS)。eNOS和nNOS合稱為結構型NOS(cNOS)。cNOS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是基本表達形式，而 iNOS是病理狀況下非正常表達［14］。nNOS主要在神經(jīng)元中表達，調節(jié)突觸可塑性，介導神經(jīng)系統(tǒng)內信號轉導，參與腦缺血后的神經(jīng)毒性作用。eNOS主要分布在腦血管組織，也分布于支氣管內皮、小靜脈、毛細血管以及心臟微血管內皮中，eNOS是細胞的正常成分。iNOS主要表達于小膠質細胞、星形膠質細胞、中性白細胞和巨噬細胞。腦缺血后，缺血區(qū)中性粒細胞、巨噬細胞等炎性反應細胞浸潤，這些炎性反應細胞及受損細胞產(chǎn)生的細胞因子能夠誘導產(chǎn)生大量的iNOS，造成NO的大量持續(xù)的釋放，參與缺血后的神經(jīng)毒性作用，加重腦損傷［15］。本實驗就SSF對慢性腦缺血后不同類型的NOS蛋白的表達情況進行了研究。實驗結果顯示腦缺血模型組大鼠海馬細胞中nNOS和iNOS免疫陽性表達明顯增加;eNOS免疫陽性細胞明顯減少，17.5和70.0 mg/kg SSF治療38 d能不同程度的改善模型組大鼠海馬細胞中NOS蛋白表達紊亂的現(xiàn)象。

綜上所述，SSF可以顯著縮短腦缺血模型組大鼠找到平臺的游泳路程;增加腦組織中ChAT蛋白的表達，提高膽堿能神經(jīng)元活性，改善記憶障礙;減少nNOS和iNOS蛋白的表達，增加eNOS蛋白的表達，減輕NO氧化帶來的損傷，從而對慢性腦缺血學習記憶障礙起到改善作用。

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