袁 寧 趙俊英

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院皮膚科，北京 100050)

光子嫩膚技術(shù)是使用連續(xù)波長(zhǎng)的強(qiáng)脈沖光(intense pulsed light，IPL)在低能量密度下進(jìn)行的非剝脫性、非侵入性嫩膚治療技術(shù)。作為一種無創(chuàng)的嫩膚手段，近年來深受廣大患者及從業(yè)醫(yī)生的青睞?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的主要蛋白酶?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是一族內(nèi)源性抑制因子，可以高度地、有選擇地抑制MMPs或其前體而表現(xiàn)出許多生物學(xué)活性，2者維持著細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。

本實(shí)驗(yàn)通過采用免疫組化法檢測(cè)光照前后人皮膚中MMPs和TIMP的表達(dá)，以明確2者在舊基質(zhì)的降解和新生基質(zhì)的重排過程中所起的作用，通過基質(zhì)與酶的變化的相關(guān)性研究，進(jìn)一步闡述強(qiáng)脈沖光光子嫩膚的作用機(jī)制。

1 資料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取6名就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼皮膚科的患者，皮膚類型為Ⅲ～Ⅳ型(Fitzpatrick分型)，年齡28～46歲，男7例，女3例?；颊呔炇鸩±韺W(xué)取材的知情同意書。

1.2 主要儀器

全自動(dòng)脫水機(jī)、自動(dòng)石蠟包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)、電熱恒溫烤箱(均來自德國Leica公司)，光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)，Lumenis One光子嫩膚儀(美國科醫(yī)人公司)。

1.3 主要試劑

兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶I單克隆抗體、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶Ⅷ單克隆抗體(武漢Boster公司)，兔抗人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子單克隆抗體、兔抗人金屬蛋白酶組織抑制因子Ⅰ多克隆抗體、試劑A聚合物輔助劑、試劑B辣根酶標(biāo)記山羊抗兔/小鼠IgG多聚體(北京中杉金橋公司)。

1.4 研究方法

志愿者照光部位(2例為左腹部，4例為上肢)0.9%氯化鈉注射液清潔后，皮膚表面涂IPL冷凝膠，進(jìn)行強(qiáng)脈沖光嫩膚治療。根據(jù)受試者Fitzpatrick分型、膚色、皮損性質(zhì)、部位、密度等制定個(gè)體化治療方案，選擇恰當(dāng)?shù)腎PL治療參數(shù)560 nm/590 nm的濾光片，采取單/雙/三脈沖的不同脈沖方式，脈寬為2.0～4.0 ms，脈沖延遲為 25～40 ms，能量密度為 16-20 J/cm2，治療間隔為3周，治療次數(shù)為3～4次。

1.5 組織學(xué)觀察

分別于照光部位及其周邊非照光部位各取1塊皮膚，裁剪成約5 mm×5 mm×5 mm大小，2例志愿者3次治療后2周病理取材，2例3次治療后3周病理取材，2例4次治療后3周病理取材。所有皮膚樣本均以10%甲醛緩沖固定液固定待用。固定的標(biāo)本石蠟包埋、切片，厚度3 μm，APES膠片撈片后置烤箱60℃，進(jìn)行常規(guī)免疫組化染色。光鏡下觀察。

1.6 結(jié)果判斷

MMP-1、MMP-8、TIMP-1表達(dá)陽性時(shí)，在切片中可見胞質(zhì)內(nèi)有深淺不同的棕黃色顆粒，按照所有標(biāo)本的平均染色強(qiáng)度由無到強(qiáng)劃分為 －，+，++，+++四級(jí)［1］。

2 結(jié)果

2.1 MMP-1在皮膚中的表達(dá)

抗原陽性時(shí)在切片中可以看到棕黃色顆粒。從切片中可以看到，正常皮膚中無MMP-1表達(dá)(圖1A，顆粒層深色顆粒為色素沉著)，3次IPL照射后2周陽性表達(dá)較照射前增強(qiáng)(圖1B)，3周時(shí)的表達(dá)較照射前也有所增強(qiáng)(圖1C)，但弱于照射2周時(shí)的表達(dá)。從圖1B、1D可以看出，4次IPL照射后皮膚中的MMP-1陽性表達(dá)較3次IPL照射后的表達(dá)多。圖1B顯示，腹部皮膚經(jīng)IPL照射后，MMP-1的表達(dá)也有所改變。

2.2 MMP-8在皮膚中的表達(dá)

抗原陽性時(shí)切片中可以看到棕黃色顆粒。正常皮膚中無MMP-8表達(dá)(圖2A)。3次IPL照射后2周有陽性表達(dá)，真皮中可見表達(dá)陽性棕黃色顆粒(圖2B)，照射后3周時(shí)皮膚真皮中也有所表達(dá)(圖2C)，但弱于照射2周時(shí)的表達(dá)。4次IPL照射的皮膚真皮中陽性表達(dá)(圖2D)強(qiáng)于3次照射后的表達(dá)。圖2D示腹部皮膚照射前后的MMP-8的表達(dá)也有所改變。而且，整體看來，MMP-8在真皮中的表達(dá)弱于MMP-1的表達(dá)。

2.3 TIMP-1在皮膚中的表達(dá)

正常皮膚中無TIMP-1表達(dá)(圖3A)，3次IPL照射后2周真皮有陽性顆粒出現(xiàn)(圖3B)，第3周時(shí)的表達(dá)較照射前也有所增強(qiáng)(圖3C)，與2周時(shí)的表達(dá)相比無明顯改變。4次IPL照射后2周時(shí)真皮層有較多陽性顆粒出現(xiàn)，并有成纖維細(xì)胞表達(dá)陽性(圖3D)。

3 討論

皮膚老化一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題。光子嫩膚技術(shù)是使用連續(xù)的強(qiáng)脈沖光在低能量密度下的非消融性方式的嫩膚治療，簡(jiǎn)言之是采用強(qiáng)光源對(duì)光老化的皮膚進(jìn)行改善。Anderson R R等［1］在1983年首次提出光子嫩膚作用機(jī)制為選擇性光熱解效應(yīng):如果皮膚中的病損組織對(duì)光輻射產(chǎn)生選擇性吸收，并將產(chǎn)生的熱能限制在一定空間內(nèi)，那么在此區(qū)域內(nèi)的生物組織受到熱破壞，而周圍的正常組織不受損害，病損組織吸收熱能被分解，并通過代謝吸收分解產(chǎn)物。

正常皮膚中最為豐富的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)成分就是膠原，最豐富的膠原類型是Ⅰ型膠原，占皮膚膠原的80%～85%，且是人體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其次是Ⅲ型膠原，占10%左右。而光老化的主要組織學(xué)特征是皮膚基質(zhì)構(gòu)成的改變，即膠原成分的減少和異常彈性纖維沉積［2］。此時(shí)重建結(jié)締組織，這需要細(xì)胞外基質(zhì)組成成分的降解和清除，以及新成分的合成和沉積。所以，膠原的合成和降解在此過程中的重要性是顯然的。

許多酶可降解ECM中的膠原成分，分為4大類:絲氨酸蛋白酶類、半胱氨酸蛋白酶類、天冬氨酸蛋白酶類、基質(zhì)金屬蛋白酶類。其中，MMPs是一組降解ECM的最重要的蛋白酶［3-4］。

圖1 MMP-1在皮膚中的表達(dá)免疫組化染色Fig.1 Expression of MMP-1 in skin with immunohistochemical staining(HE stain 10×)

其中MMP-1，MMP-8以Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白為底物。在正常機(jī)體中，MMPs的活性非常低并由內(nèi)源性的組織抑制劑TIMPs調(diào)節(jié)。TIMPs是阻斷ECM降解、抑制MMP活性的一組分泌糖蛋白。它是一個(gè)多基因家族的編碼蛋白，由成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生，廣泛分布于組織和體液中。目前已被成功克隆出 4個(gè)成員:TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4［5-7］。TIMP 在組織重塑中的主要作用是與MMP形成1∶1復(fù)合物從而抑制MMP的能力。2者維持著細(xì)胞外基質(zhì)的平衡。雖然每種TIMP均可抑制所有的MMP，但TIMP-1可優(yōu)先抑制MMP-1。

本實(shí)驗(yàn)前期研究［8］對(duì)IPL治療前后彈力纖維的圖像定量分析結(jié)果顯示其面積密度以降低為主，但肉眼觀察切片中聚集成團(tuán)塊狀的彈力纖維消失，取而代之的是較為纖細(xì)、分布更廣、排列更加均勻整齊的新的彈力纖維，另外Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維的面積密度以增加為主，且其排列更加整齊并交織成規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，纖維間間隙明顯縮小，纖維排列致密，纖維的直徑明顯變細(xì)，說明膠原纖維為更加幼稚的新生的膠原纖維。我們懷疑是某些細(xì)胞在接受光能后分泌某種酶及細(xì)胞因子，刺激新的膠原生成。到目前為止，研究IPL的分子生物學(xué)機(jī)制方面的報(bào)道還很少，因此有必要進(jìn)行較深入的該方面研究，這對(duì)于IPL的應(yīng)用將有重要的理論意義。

本實(shí)驗(yàn)表明正常皮膚中無MMP-1表達(dá)，IPL照射后真皮中發(fā)現(xiàn)MMP-1及MMP-8的表達(dá)增強(qiáng)，此時(shí)MMP-1及MMP-8的表達(dá)有利于清除變性的膠原。而照射后3周時(shí)的陽性表達(dá)弱于照射2周時(shí)的表達(dá)，這時(shí)有利于新的膠原纖維形成，這與我們前期實(shí)驗(yàn)觀察切片中特染組織的面積及厚度的改變，發(fā)現(xiàn)第3周時(shí)Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的改變呈上升趨勢(shì)相吻合。同時(shí)，從本研究結(jié)果可以顯示，4次IPL照射后皮膚中的MMP-1陽性表達(dá)較3次IPL照射后的表達(dá)強(qiáng)。所以，增加治療次數(shù)，將會(huì)清除更多的變性Ⅰ、Ⅲ型膠原，從而有更多新生膠原纖維生成。

圖2 MMP-8在皮膚中的表達(dá)免疫組化染色Fig.2 Expression of MMP-8 in skin with immunohistochemical staining(HE stain 10×)

正常皮膚中TIMP-1無表達(dá)，IPL照射后真皮有陽性顆粒出現(xiàn)，但第2周和第3周時(shí)真皮內(nèi)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有成纖維細(xì)胞表達(dá)陽性。

TIMP-1的一個(gè)重要作用就是抑制 MMP-1及MMP-8對(duì)ECM成分的降解。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)MMPs在2周時(shí)的表達(dá)強(qiáng)于3周時(shí)的表達(dá)，而TIMP-1在真皮中的表達(dá)在第2周和第3周無明顯差異，這表示，在2周前主要是以清除變性膠原為主，而2周后，TIMP抑制MMPs對(duì)膠原的過多降解，有利于真皮中新生基質(zhì)成分的沉積，對(duì)皮膚的重塑是有意義的。此過程中，TIMP-1一直起監(jiān)察員的作用。

國內(nèi)王明利等［9］對(duì)大鼠皮膚的強(qiáng)脈沖光實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)了這一變化，但是我們未觀察到強(qiáng)脈沖光治療后這些酶在漢族人皮膚上的強(qiáng)陽性表達(dá)，考慮可能與以下因素有關(guān):① 照射對(duì)象及部位:前者是大鼠背部皮膚，本實(shí)驗(yàn)是漢族人的上肢及腹部皮膚。② 治療參數(shù):前者通過測(cè)試光斑，用了相同的治療參數(shù):能量密度34 J/cm2，脈寬各為4、5及6 ms，脈沖延時(shí)為20 ms及25 ms。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)受試者Fitzpatrick分型、膚色、部位等制定個(gè)體化治療方案，選擇恰當(dāng)?shù)腎PL治療參數(shù):560 nm/590 nm的濾光片，采取單/雙/三脈沖的不同脈沖方式，脈寬為2.0～4.0 ms，脈沖延遲為25～40 ms，能量密度為16～20 J/cm2，這與我們?cè)谂R床應(yīng)用時(shí)所用的治療參數(shù)是相似的。

研究者還觀察到，腹部皮膚經(jīng)IPL照射后的MMP-1、MMP-8及TIMP-1在真皮中表達(dá)也增強(qiáng)，且其規(guī)律性和光暴露部位(上肢)的陽性表達(dá)相似，因此認(rèn)為IPL不僅能治療光老化，并且對(duì)自然老化也有一定的療效。

本實(shí)驗(yàn)觀察了IPL作用于人皮膚中的MMP-1、MMP-8及TIMP-1的表達(dá)變化，表明3者在光子嫩膚導(dǎo)致的熱損傷中起一定的作用，為闡明IPL的分子生物學(xué)機(jī)制提供了一定的理論基礎(chǔ)。IPL的分子生物學(xué)機(jī)制還涉及很多的酶和因子，本實(shí)驗(yàn)只觀察了3種酶的變化，其他酶和因子在IPL作用機(jī)制中的變化及相關(guān)關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究。

圖3 TIMP-1的表達(dá)免疫組化染色Fig.3 The expression of MMP-8 in skin with immunohistochemical staining(HE stain)

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