武警陜西總隊(duì)醫(yī)院(西安 710054) 徐 皓 程隨濤 張衍國(guó) 呂雅潔 張惠中 余春艷

銀屑病是一種表皮過(guò)度增殖為特征的慢性皮膚病,發(fā)病機(jī)理尚不明確,近年來(lái)研究表明銀屑病皮損中成纖維細(xì)胞存在異常,認(rèn)為成纖維細(xì)胞可能是銀屑病發(fā)病的重要因素之一。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)作為一種炎癥因子,在銀屑病的發(fā)病中具有重要作用,我們采用 GeneChip Human Genome U133 Plus2.0芯片研究以 TNF-α為刺激條件下,尋常型銀屑病患者成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化情況,為進(jìn)一步研究成纖維細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的作用提供相應(yīng)的理論支持。

材料與方法

1 材 料 胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司,DMEM、PBS購(gòu)自 GIBCO公司,硫酸鏈霉素、氨芐青霉素購(gòu)自華北制藥股份公司,TRIZOL購(gòu)自INVIT ROGEN公 司,TNF-α購(gòu) 自 ABD公司。GeneChip Human Genome U133 Plus2.0芯片為Affymetrix公司產(chǎn)品。

2 方 法 ①成纖維細(xì)胞的培養(yǎng):見(jiàn)參考文獻(xiàn)[1]。利用小鼠抗型膠原一抗進(jìn)行細(xì)胞鑒定。②TNF-α對(duì)皮膚成纖維細(xì)胞基因表達(dá)影響的檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組加入 TNF-α15ng/ml,72h培養(yǎng),空白對(duì)照組未加。貼壁細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)結(jié)束后,棄去培養(yǎng)液基。加入 Tizol,按照Trizol總 RNA抽提試劑盒說(shuō)明書分別提取總 RNA,用電泳及分光光度計(jì)測(cè) A260/A280鑒定 mRN A質(zhì)量。 RNA定量,反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈 cDNA并進(jìn)行純化。用Bio Array High Yield RNA Transcrip tLableling體轉(zhuǎn)錄合成生物素化 cRNA。cRNA片斷化,與Affymetrix133芯片雜交、染色、洗滌。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用 Microarray SuitVersion 5.0和 Data Mining Tool Version 2.0獲取芯片雜交信息,進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。采用 Genmapp和 Mappfinder進(jìn)行功能聚類和途徑分析,該軟件中的數(shù)據(jù)庫(kù)(生物途徑圖)來(lái)源于 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),并與 Gene Ontology(GO)Consortium鏈接,在 Genmapp運(yùn)行結(jié)果的基礎(chǔ)上,對(duì)基因差異表達(dá)數(shù)據(jù)在分析生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分進(jìn)行聚類分析,并進(jìn)行顯著相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。

結(jié) 果

1 雜交與掃描結(jié)果 將基因芯片與制備的探針雜交后,掃描 Cy3與 Cy5兩種熒光信號(hào)的強(qiáng)度和比值,用專用軟件分析,差異表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)為基因表達(dá)變化在 2倍以上者為陽(yáng)性。根據(jù) GO分類與 GENE M APP分類,差異表達(dá)基因共有 730條,其中上調(diào)基因 395條,下調(diào) 335條。

2 散點(diǎn)圖分析 分別以參加比對(duì)兩組數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值(Ln)作為橫縱坐標(biāo)作圖,沿 45度對(duì)角線方向分布的基因,表示它在兩樣本中的表達(dá)量是相同的。距離對(duì)角線垂直距離越遠(yuǎn)的基因,表示它在某一樣本中的差異表達(dá)程度越大。設(shè) R=S/C(S代表縱坐標(biāo)上歸一化后的樣本數(shù)據(jù),C代表橫坐標(biāo)上歸一化后的樣本數(shù)據(jù))。

3 功能聚類分析 對(duì)差異顯著基因,即變化倍數(shù)在 2倍及 2倍以上的基因進(jìn)行 Mappfinder功能聚類分析。具體分布情況見(jiàn)表 1。

4 與免疫相關(guān)的基因名稱及生物學(xué)過(guò)程 見(jiàn)表2。

討 論

基因芯片的特點(diǎn)是大規(guī)模、高通量和高平行性地研究成千上萬(wàn)個(gè)基因的表達(dá)情況,廣泛應(yīng)用于基因功能的研究[2]。銀屑病是一種以表皮過(guò)度增殖為特征的慢性皮膚病,病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚?，F(xiàn)研究表明銀屑病患者成纖維細(xì)胞可維持銀屑病皮損表皮的高增殖狀態(tài),產(chǎn)生較高水平的 IL-6、IL-8[3]、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子[4]。故認(rèn)為銀屑病成纖維細(xì)胞通過(guò)旁分泌釋放高水平的細(xì)胞因子可能是造成角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖的重要始動(dòng)因素[5]。 TNF-α在銀屑病的發(fā)病中具有重要的作用。為了研究成纖維細(xì)胞在銀屑病發(fā)病中的作用,我們用基因芯片分析了在 TNF-α作用下,銀屑病患者成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化。結(jié)果表明在TNF-α單一因素的作用下,銀屑病患者成纖維細(xì)胞基因表達(dá)譜發(fā)生了重大變化,有 730條基因表達(dá)有明顯變化,涉及合成、分解、加工、修飾、運(yùn)輸、調(diào)控、細(xì)胞周期和凋亡等多個(gè)生物過(guò)程。在這些基因中,還有近 1/3的基因功能未知。提示在 TNF-α的刺激下成纖維細(xì)胞可能通過(guò)合成和分泌多種因子,造成細(xì)胞周圍環(huán)境的多因素變化,從而引起角質(zhì)形成細(xì)胞的過(guò)度增殖。其中涉及免疫的基因有 31條,在以往銀屑病研究中已有相關(guān)報(bào)道有 IL-15、 C3和 PLA2G4C,未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道有IL-32、CD163、CD83、PTX3、鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白 (GBP1)等。IL-15在銀屑病皮損整個(gè)表皮以及直接與表皮基底細(xì)胞接觸的真皮細(xì)胞高表達(dá),而在正常皮膚中只有表皮下部的角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)[6]。我們實(shí)驗(yàn)證實(shí)銀屑病患者成纖維細(xì)胞在 TNF-α的刺激下 IL-15的基因表達(dá)明顯升高,說(shuō)明銀屑病患者皮損中的 IL-15不僅僅是來(lái)源于免疫系統(tǒng),真皮內(nèi)的成纖維細(xì)胞可能是皮損中 IL-15的重要來(lái)源,這與以往研究相符合,同時(shí)也證明我們?cè)囼?yàn)的可靠性與結(jié)果的可信性。C3在補(bǔ)體系統(tǒng)中主要參與旁路激活途徑,表現(xiàn)為感染早期的非特異性免疫,其水解片段具有多種生物活性,如過(guò)敏毒素作用、中性粒細(xì)胞的趨化作用,增強(qiáng)炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)免疫功能和促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生等。C3對(duì)中性粒細(xì)胞具有趨化作用,中性粒細(xì)胞釋放的溶酶體激活補(bǔ)體,形成中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞的相互作用惡性環(huán)路,促使銀屑病反復(fù)發(fā)作及慢性化。

表1 按照 GO標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行生物學(xué)活性過(guò)程分類

表2 與免疫相關(guān)的基因名稱及生物學(xué)過(guò)程

PLA2G4C磷脂酶 A2(PLA2)是一類催化磷脂二位?；獾拿缸?是花生四烯酸、溶血磷脂等炎性介質(zhì)生成的限速酶,促進(jìn)炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放和激活,直接影響炎性病變的發(fā)展和預(yù)后。雖然沒(méi)有直接證據(jù)證明 PLA2與銀屑病發(fā)病相關(guān),但是體外試驗(yàn)表明 PLA2通過(guò)酶解產(chǎn)物花生四烯酸,誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞殖[7]。因此 PLA2可能與銀屑病發(fā)病相關(guān)。

IL-32是先天免疫中的關(guān)鍵效應(yīng)器。具有趨化外周血單核細(xì)胞作用。 IL-32 α通過(guò)活化 NF-κ B和 p38 MAPK的磷酸化誘導(dǎo)多種炎癥因子包括 TNF-α的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示銀屑病患者成纖維細(xì)胞在 TNF-α的刺激下,釋放 IL-32,IL-32誘導(dǎo)產(chǎn)生 TNF-α,放大TNF-α的效應(yīng),參與了銀屑病 TNF-α惡性循環(huán)的形成。CD163血色素-結(jié)合珠蛋白復(fù)合物的受體,通過(guò)調(diào)節(jié)血紅素氧合酶-1的表達(dá),參與抗炎、抗氧化作用。CD163具有單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞特異性,在炎癥組織或血液循環(huán)的單核細(xì)胞中,CD163的表達(dá)增高。IL-6,IL-10和糖皮質(zhì)激素促使 CD163表達(dá)上調(diào),而干擾素和TNF-α使其表達(dá)下調(diào)[8]。本試驗(yàn)表明 CD163可能不僅僅表達(dá)在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上,也表達(dá)在成纖維細(xì)胞上,在 TNF-α刺激下成纖維細(xì)胞的 CD163基因表達(dá)不是降低,而是明顯增高。這與以往的研究結(jié)果不符,是否由于銀屑病患者的成纖維細(xì)胞功能紊亂造成,還需進(jìn)一步深入研究。

CD83是細(xì)胞表面Ⅰ型膜糖蛋白。不僅僅是成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的標(biāo)志,還是 DC發(fā)揮其激發(fā)免疫應(yīng)答作用中不可缺少的功能分子。分為膜結(jié)合型和可溶型,膜結(jié)合型 CD83增強(qiáng) T細(xì)胞應(yīng)答,促進(jìn)免疫反應(yīng)的作用。可溶性 CD83具有強(qiáng)大的免疫反應(yīng)抑制作用,抑制DC的成熟和 T細(xì)胞的增殖[9]。 PTX3結(jié)合蛋白相關(guān)基因,是 TNF誘導(dǎo)表達(dá)基因之一。作為炎癥急性期反應(yīng)蛋白,PTX3特異性結(jié)合在凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核膜上,能夠提高血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì) TNF的敏感性,提高細(xì)胞合成 TNF誘導(dǎo)的細(xì)胞因子。GBP1鳥(niǎo)苷酸結(jié)合蛋白(GBP1),簡(jiǎn)稱 G蛋白。 由α、β和γ三個(gè)亞單位組成,α亞單位上有鳥(niǎo)苷酸結(jié)合位點(diǎn)。主要在激素受體結(jié)合的部分與腺苷環(huán)化酶之間起調(diào)節(jié)作用。當(dāng) G蛋白上結(jié)合的鳥(niǎo)苷酸為 GT P時(shí)則激活而發(fā)揮作用,但當(dāng) G蛋白上的 GTP水解為 GDPA時(shí)則失去活性。當(dāng)激素與受體結(jié)合時(shí),活化的受體與 G蛋白的α亞單位結(jié)合,促使其與β、γ亞單位脫離,通過(guò)對(duì)腺苷酸環(huán)化酶起激活或抑制作用,從而實(shí)現(xiàn)激素對(duì)細(xì)胞內(nèi)功能的調(diào)節(jié)。

試驗(yàn)中銀屑病患者成纖維細(xì)胞在 TNF-α的刺激下,不僅僅是激活免疫的細(xì)胞因子基因表達(dá)增高,而且抑制免疫的細(xì)胞因子基因表達(dá)也升高。此外還涉及到炎癥、細(xì)胞增殖與凋亡等多方面原因,其病理變化不是一種細(xì)胞因子造成的,而是多種細(xì)胞因子共同改變的結(jié)果,許多基因其生物學(xué)過(guò)程與功能并不是十分清楚。越來(lái)越多的研究表明 TNF-α與銀屑病關(guān)系密切。說(shuō)明銀屑病患者皮膚成纖維細(xì)胞可能合成免疫相關(guān)細(xì)胞因子的功能失衡,在銀屑病的發(fā)病中具有重要的意義。這些免疫相關(guān)的基因與銀屑病的發(fā)病關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。

[1] 李海紅.人皮膚成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[J].中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué)雜志,2005,17(2):89.

[2] Dasu M R,Hawkins HK,Barrow RE,et al.Gene expressi on profiles from hypertrophic scar fibroblasts before and after IL-6stimulation[J].J Pathol,2004,202:476～ 485.

[3] Zalewska A,Glowacka E,Wyczolkowska J,et al.Sysa-Jedrzejowska,Interleukin 6 and 8 levels in plasma and fibroblast cultures in psoriasis[J].Mediators Inflamm,2006,81:767.

[4] Kovacs D,Falchi M,Cardinali G,et al.Immunohistoche mical analysis of keratinocyte growth factor and fibroblast growth factor10 expression in psoriasis[J].Exp Dermatol,2005,(14):130-137.

[5] 趙小東,付 萌,盧 濤,等.銀屑病成纖維細(xì)胞培育上清對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響 [J].中華現(xiàn)代皮膚科學(xué)雜志,2004,1(2):34-35.

[6] 張國(guó)龍,張學(xué)軍,張勝權(quán),等.IL-15在尋常型銀屑病患者皮損中的表達(dá) [J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2006,(04):34-35.

[7] Sjursen W,Brekke OL,Johansen B.Secretory and cytos olic phospholipase A(2)regulate the long-term cytokineinduced eicosanoid production in human keratinocytes[J].Cytokine,2000,(12):1189-1194.

[8] Weaver LK,Pioli PA,Wardwell K,et al.Up-regulation of human monocyte CD163 upon activation of cell-surface Toll-like receptors[J].J Leukoc Biol,2007,(18):663-671.

[9] Fujimoto Y,Tu L,Miller AS,et al.CD83expression influences CD4+T cell development in the thymus[J].Cell,2002,108:755-767.